广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域克隆及序列分析

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74%以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80%以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

大豆孢囊线虫扩展蛋白新基因(Hg-exp-1、Hg-exp-2)的鉴定及功能分析

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。     

Cloning and sequence analysis of DM domain of Dmrt gene in Guangxi Naja naja atra

[目的]了解广西眼镜蛇Dmrt基因DM结构域特性,为探讨眼镜蛇性别决定和分化发育的分子机制及证实Dmrt基因家族在爬行动物进化中的保守性提供理论依据.[方法]以广西眼镜蛇为材料,采用简并PCR扩增克隆眼镜蛇Dmrt基因DM结构域,并分析其与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄等相应Dmrt基因DM结构域的同源性及系统进化关系.[结果]克隆获得广西眼镜蛇Dmrt基因家族的两个成员,分别命名为Nn1 Dmrt和Nn2 Dmrt.经系统进化分析,发现两个Dmrt基因DM保守区核酸序列与人、猕猴、牛、小鼠、大绿蛙、中华蟾蜍、扬子鳄相应Dmrt基因保守区核酸序列的相似性均在74％以上,其推导氨基酸序列的相似性均在80％以上.[结论]Dmr基因DM结构域编码序列在不同物种中同源性较高,Dmrt基因家族在动物系统进化上具有高度的保守性.     

香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA，以mRNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，设计expansin的简并引物，进行RT-PCR(退火温度为50℃)，得到的扩增产物纯化后与pGEM-T-Easy载体连接，转化大肠杆菌，任意挑选2个阳性克隆，进行序列分析，结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段，命名为MA-Exp3(以示与已登录的香蕉MA-Expl和MA-Exp2的区别)，MA-Exp3中存在expansin基因的保守区域，即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基，它编码177个氨基酸，与MA-Exp1的核苷酸同源性为74．2％，氨基酸同源性为86．4％。     

葡萄bHLH转录因子家族全基因组分析

通过生物信息学的方法,鉴定得到110个葡萄的bHLH基因,分别命名为VvbHLH001^VvbHLH110。葡萄bHLH基因可以分为24个亚家族,以非随机的方式分布在19条染色体上,其中有10组基因发生了串联复制。基因芯片表达分析显示葡萄bHLH基因具有器官特异性表达,如亚家族Ib(2)在根中特异表达,可能与根活力有关;VvbHLH003和VvbHLH16基因在花蕊及花序中特异表达,推测与花器官发育有关。研究结果可为进一步开展bHLH家族的基因功能和分子进化机制的研究提供基础。     

玉米全基因组中NAC基因家族的鉴定与分析

本试验利用生物信息学方法预测了玉米NAC基因家族成员、基因结构、染色体定位和系统进化关系。结果表明,玉米NAC基因家族包含128个成员,依据其在染色体上的位置系统命名为Zm NAC001~Zm NAC128;Zm NAC分布在10条染色体上,且分布不均;Zm NAC基因与拟南芥NAC基因具有一定相似性,可分为13个亚家族;基因结构分析发现绝大多数Zm NAC基因含有1~3个内含子;miRNA靶基因预测发现7个Zm NAC基因为miRNA164的靶基因。     

梨树CDPK基因家族进化和表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK或CPK)在植物生长和发育、逆境信号刺激及其对病原物的防御反应过程中发挥着非常重要的作用。本研究利用梨树全基因组数据,采用生物信息学的方法,在全基因组水平上对梨树CDPK基因家族进行系谱进化关系、基因结构、共线性关系及表达情况等分析。结果表明,梨树基因组中共存在31个CDPK基因,命名为PbCDPK1~PbCDPK31。系谱分析结果表明,这些CDPK基因归属于4个亚家族。共线性分析检测到12对CDKP基因间存在显著的共线性关系,其中10对由最近一次发生的全基因组复制事件形成。非同义/同义置换率的比率(dN/dS)说明CDPK基因在功能上进化得非常保守。荧光定量PCR结果发现,5个梨树CDPK基因对干旱逆境有响应。试验结果可为进一步开展梨树CDPK基因家族的功能鉴定和分子进化机制的研究提供参考。     

桑树类甜蛋白家族鉴定与生物信息学分析

为了全面分析桑树类甜蛋白家族基因特征,从桑树全基因组中鉴定类甜蛋白家族(Thaumatin-like protein,TLP)基因,并对基因结构和组成、蛋白质结构域和系统进化以及密码子使用特性进行分析。通过研究,筛选并鉴定了25个桑树TLP家族成员。多数具有典型的索马甜家族标签和保守氨基酸残基。基因结构分析结果表明,12个TLP基因家族成员含有1个内含子,10个成员含有2个内含子,且内含子相位较保守。系统进化分析结果显示,桑树TLP分为8个聚类组,组内序列一致性较高。密码子偏性分析结果显示,桑树TLP家族基因密码子第3位的核苷酸使用偏性较弱,多数基因的进化主要是由碱基随机突变造成的,属于低表达基因,少数基因受自然选择压力影响,基因表达水平较高,在植物响应环境胁迫中发挥作用。     

尼瓦拉野生稻FKBP基因家族的鉴定及功能分析

用HMMER软件,根据FKBP蛋白特征保守结构域初步鉴定了FKBP家族蛋白,再对初步鉴定的FKBP家族蛋白序列进行Pfam数据库保守结构域搜索,进一步甄别确定。据此得到尼瓦拉野生稻FKBP基因25个,转录本40个;亚洲栽培稻FKBP基因26个,转录本33个。根据尼瓦拉野生稻和亚洲栽培稻FKBP蛋白的系统进化关系和相关注释信息对尼瓦拉野生稻FKBP基因家族成员进行了命名,并用在线软件对比分析了尼瓦拉野生稻和亚洲栽培稻FKBP家族蛋白理化性质、转录本结构和蛋白保守基序,初步讨论了尼瓦拉野生稻与对应的亚洲栽培稻FKBP家族成员间的异同点,并结合NCBI的SRA数据库中相关RNA测序数据分析FKBP基因在不同生长时期和不同器官内的表达情况,为相关研究提供有益参考。     

植物UGD基因家族系统发育分析及在棉纤维中的表达分析

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-glucose dehydrogenase,UGD)是植物细胞壁合成的主要前体物质。本研究利用生物信息学方法分析了15个植物基因组中UGD基因家族的基因结构,系统进化,以及其中7个双子叶植物的种内共线性,染色体定位。利用荧光定量PCR方法分析了UGD家族基因在陆地棉棉纤维不同发育时期的表达。结果表明:15个物种中共鉴定出56个UGD基因,可聚为2个进化群,藻类单独成一个群,其他植物构成一个群,各物种均有UGD家族基因的特异进化枝。藻类植物UGD家族均含有内含子。大片段复制是UGD家族基因扩增的主要动力。12个陆地棉UGD基因在棉纤维不同发育时期均有表达,多数基因在20DPA或25DPA基因表达量较高。     

大豆LIM转录因子家族鉴定及盐胁迫响应分析

为探究大豆LIM转录因子家族基因在应答盐胁迫中的功能,利用生物信息学方法,根据大豆全基因组数据,共鉴定出21个LIM基因,命名为GmLIM01～GmLIM21,分析大豆LIM基因家族的染色体位置、蛋白质的理化性质、进化关系、保守基序以及对非生物逆境胁迫的响应。结果表明,这些GmLIM基因在大豆20条染色体中的14条染色体上分布不均,片段重复是大豆LIM家族扩大的主要原因。根据系统发育进化分析,大豆21个LIM基因可分为5个亚家族,与其他9个物种的LIM基因一起构建进化树,也可分为5个亚家族。大豆的21个GmLIM基因共包含10个基序,大部分LIM蛋白含有motif 1、motif 2和motif 4这3个保守基序。此外,顺式调控元件的分析表明,在GmLIM基因的启动子序列中,与光响应、生长发育、植物激素和非生物逆境胁迫应答相关的调控元件非常丰富。定量PCR结果表明,在盐胁迫处理后大豆叶和根中GmLIM07、GmLIM17基因的表达量分别在3和6 h达到峰值,后随着处理时间的加长表达量下降。综上GmLIM基因在大豆的盐胁迫应答过程中具有重要的调控作用。     

玉米TCP家族基因生物信息学鉴定与分析

TCP家族是一类与植物器官三维形态发育或细胞周期调控相关的转录因子。本研究通过SeqHunter2软件,在玉米基因组范围内进行TCP家族基因的搜索和鉴定。共鉴定了7个玉米TCP家族基因,并根据进化树拓扑结构将其分为两大类:ClassⅠ和ClassⅡ。通过玉米、拟南芥和水稻TCP家族的进化分析推测,玉米发生了特有的TCP家族基因扩增事件,这些物种分化后进化出的基因可能参与了玉米特有的生命活动或与玉米特有的生物特征相关。玉米7个TCP转录因子的保守基序在组成上存在差异,但均含有TCP家族中最保守的两个基序。     

植物NRT2家族的分子进化

为了研究硝酸盐转运子NRT2家族在植物中的进化关系,综合利用共线性信息和序列相似性信息,从8种已经进行过全基因组测序的物种(大白菜、大豆、杨树、葡萄、玉米、水稻、高粱、二穗短柄草)中,搜索拟南芥NRT2的同源基因。通过分析发现,这些基因序列基本都具有MFS超家族的NNP家族基因的典型特征。但单、双子叶植物之间,NRT2的基因结构存在着较大的差异。系统发育重建结果表明,NRT2基因家族的成员主要是在单、双子叶植物分歧后进化产生的;同时,不同植物的NRT2基因又具有不同的进化模式。大白菜NRT2家族经历了基因组三倍化事件及基因片段丢失。因此,拟南芥和大白菜的NRT2家族有较为密切的进化关系,进化分析为利用已有的拟南芥NRT2研究结果进一步在大白菜中开展NRT2的功能研究提供了参考线索。     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

桑树NBS-LRR类基因家族的全基因组鉴定及其调控microRNAs分析

利用生物信息学方法,全面分析了桑树NBS-LRR类基因家族组成、结构、进化、组织表达,并对该家族基因的调控microRNA(miRNA)进行了预测。共筛选到112个桑树NBS-LRR类基因,根据功能域主要分为NBS、CC-NBS、CC-NBS-LRR、NBS-LRR 4种类型。内含子数和相位分析结果显示,基因结构类型多样。聚类分析结果显示不同聚类组间存在较多的类型交叉现象。该家族基因存在组织表达特异性。大部分桑树NBS-LRR类基因均具有被miRNAs调控的可能性,miR472b和miR482b在调控该家族基因表达中可能发挥了主要作用。桑树NBS-LRR家族基因结构和进化的复杂性决定了其功能的多样性,miRNA在控制该家族基因表达的适应性成本中发挥作用。     

稻瘟病菌Subtilases家族生物信息学分析及其中一蛋白的分泌性检验

根据已有的研究结果推测稻瘟病菌Subtilases家族基因可能在其致病过程中具有重要的功能,本研究以进化理论为基础,结合一些生物信息学的软件对稻瘟病菌基因组中Subtilases家族基因进行了比较基因组、进化分析及功能域分析,分析了Subtilases家族对稻瘟病菌致病性的重要性,并推测家族中不同基因的结构、功能及参与的生理过程可能的异同之处,以基因MGG_07965.6为例,分析其可能具有的生物学功能,并通过实验的方法证实了其基因表达产物确是分泌蛋白。     

荷花MADS-box基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从微山红莲花苞中克隆获得1个与花发育相关的MADS-box基因,命名为Ne MADS1。该基因全长729 bp,包含1个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域。序列比对和系统进化分析结果表明,Ne MADS1与E类家族AGL9/SEP-like3基因亲缘关系较近。RT-PCR分析结果表明,Ne MADS1基因在花瓣、雄蕊和心皮中表达。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

芫荽NPR1-like家族全基因组鉴定及分析

为研究芫荽NPR1-like基因家族的进化和功能,利用生物信息学手段,从芫荽全基因组中鉴定出7个NPR1-like基因,将其命名为CsNPR1～7,并对其理化性质、系统发生关系、保守结构域、基因结构、启动子区顺式作用元件和表达模式进行预测和分析。结果表明,芫荽7个NPR1-like基因家族成员在进化上分为CladeⅠ、CladeⅡ和CladeⅢ共3个分支,序列中有典型的BTB/POZ和锚蛋白重复结构域,含有1～3个内含子。芫荽NPRs不仅在蛋白序列中涉及构象变化、核定位及水杨酸(SA)结合等核心功能位点与拟南芥高度保守,而且在基因结构上也与拟南芥NPRs相似,暗示着二者可能具有类似的功能。CsNPRs基因启动子区域含有与激素响应、逆境胁迫和植物生长发育相关的顺式作用元件。基因表达分析结果显示,CsNPRs的表达部位和时期各不相同,暗示着芫荽NPR1-like基因家族成员可能在调控芫荽不同组织和不同时期生长发育过程中发挥不同作用。     

谷子膜结合脂肪酸脱氢酶基因家族的鉴定及进化分析

以谷子基因组数据库为平台,借用生物信息学手段,对谷子膜结合脂肪酸脱氢酶(FAD)基因家族进行全基因水平上的鉴定及进化分析。结果表明,谷子中含有9个膜结合FAD成员,通过与拟南芥和水稻的膜结合FAD成员一起构建进化树,将其划分成4个亚家族,并发现第一类脱氢酶亚家族的基因在谷子中发生了缺失。此外,谷子膜结合FAD中各个亚家族的基因结构表现出一定的保守性,并且这种保守与其进化关系高度吻合;谷子中仅发现1对膜结合FAD复制基因SiFAD3.1/SiFAD3.2,且该次基因复制事件属于片段复制。研究结果可为谷子膜结合FAD家族的鉴定及分子进化研究提供重要的理论依据。