一株番茄枯萎病生防菌的鉴定、定殖与盆栽防效研究

[目的]从多年种植的大田土壤中分离出一株拮抗番茄枯萎病菌的细菌S-13,对其进行初步鉴定,并测定其定殖能力和防治效果.[方法]16S rDNA系统发育分析初步鉴定菌株种属,利用该菌株的耐受300μg/mL抗利福平的突变菌株,采用盆栽试验和DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析方法,分别测定拮抗菌S-13突变菌株对番茄枯萎病的盆栽防治效果、定殖能力以及对其根际土壤菌群的影响.[结果]S-13菌株初步鉴定为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens GU323369.1)的近似种.盆栽试验表明:灌根组和喷施组在45 d内对番茄枯萎病的发生均具有较好的控制作用,对番茄枯萎病的防效达100;和93;.拮抗菌接种后7、25和45 d的分离培养表明:拮抗菌S-13能够在番茄根际土壤、根、茎、叶中定殖,土壤和根中的定殖数量较高,到第45 d达1.6×105 cfu/g根际土壤和6.6×104 cfu/g鲜根重,但在茎和叶中的定殖并不稳定,到45 d时只在灌根组的叶中检测到有生长为4×102 cfu/g鲜叶重.同时DGGE分析表明S-13在分离土壤是优势菌之一,在接种的第25 d土壤中细菌多样性降低,但在45 d检测时对土壤中细菌的影响逐渐减小,逐步形成一个具有拮抗细菌存在的、稳定的细菌群落结构.[结论]番茄枯萎病菌拮抗菌S-13能够在番茄根际土壤、根、茎、叶中定殖,土壤和根中的定殖数量较高,能够抑制番茄枯萎病的发生及扩散,具有较高的实际应用价值,为进一步的应用奠定了基础,也为番茄枯萎病的生物防治提供了新的选择.     

暹罗芽孢杆菌Y-54对番茄叶霉病的生防作用

为明确暹罗芽孢杆菌Y-54对番茄叶霉病的生防作用,给番茄叶霉病的生物防治提供科学依据,采用对峙及显微观察方法测定菌株Y-54对导致番茄叶霉病的黄褐孢霉菌的抑制作用,以灌根法研究拮抗菌株Y-54在番茄中的定殖变化,采用浸种法和灌根法研究菌株Y-54对番茄种子萌发和幼苗生长的促生作用,并通过盆栽试验测定了防治效果。结果表明,菌株Y-54及其发酵液和无菌滤液均对番茄叶霉病菌有较强的抑制作用,抑制率分别达到78.42%、86.42%和91.26%;无菌滤液可使番茄叶霉病菌菌丝变形弯曲、萎缩、膨胀、断裂等;菌株Y-54在接种30 d内均可在番茄根茎叶部位定殖,15～18 d时达到定殖高峰,其中在根部的定殖量始终高于其他部位。菌株Y-54可以有效地促进种子的萌发,其发酵原液（0×）可使种子发芽率达到最高,为93.33%;并且能有效促进幼苗根长、株高、鲜质量、叶绿素含量等各项指标的增长,发酵原液（0×）和10×、20×发酵液的促生作用显著高于无菌水（CK）。菌株Y-54发酵原液（0×）对番茄叶霉病的防效在7 d和14 d时分别达68.04%和71.07%,接近于苯醚甲环唑处理,显著高于喷施多菌灵处理...     

3株植物内生细菌对番茄灰霉病的防治效果

从中草药透骨草、白鲜皮和番茄植株体内筛选出3株对灰霉菌有较强抑制作用的内生拮抗细菌,离体番茄果实灰霉病防治和盆栽防治试验结果表明,3个菌株对番茄灰霉病均有较好的防治效果,先接种拮抗内生细菌24 h后再接种灰霉菌的防效优于同时接种拮抗菌和病原菌的防效;拮抗菌株T15对番茄灰霉病的防治效果优于菌株B2和F8的防治效果。     

1株海洋芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的防治效果及防治机制研究

为研究1株海洋芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的防治效果及防治机制,从室内生测、盆栽药效及田间药效3个方面研究了1株海洋芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的防治效果。同时,从拮抗作用、定殖特性、诱导抗病性3个方面来研究其生防机制。室内生测及盆栽药效结果表明,该菌株对灰霉病菌的抑菌作用显著优于对照药剂嘧霉胺(P<0.05),其发酵液处理在接种病原菌5 d后对黄瓜灰霉病的盆栽防效为83.23%。此外,菌株制剂300倍液对灰霉病的田间治疗效果达77.31%。防治机制研究表明,该菌株发酵上清液能使灰霉病菌菌丝畸形生长,原生质浓缩并外渗,导致菌丝死亡;能抑制灰霉病菌孢子萌发,并导致萌发孢子不能正常生长;该菌株能在黄瓜苗的根、茎、叶等生态位点良好定殖,定殖量维持在10万～100万CFU/g;黄瓜苗经菌株发酵液处理后,与抗病相关的过氧化物酶和过氧化氢酶活性均升高,CAT对应的基因转录量也增加,从生理水平和转录水平说明该菌株发酵液对黄瓜有诱导抗病性的作用。说明该株海洋芽孢杆菌对黄瓜灰霉病有较好的防治效果,且防治机制包括抑菌、定殖和诱导抗病性。     

2株内生拮抗细菌对灰霉病菌的抑菌活性研究

采用对峙培养法检测了2株内生拮抗细菌对灰霉病菌菌丝生长的影响,并观察了其发酵液对灰霉病菌孢子萌发及病菌生长的影响,同时测定了其发酵液、细菌悬浮液以及高温处理的发酵液在离体黄瓜上对灰霉病菌生长的抑制作用。结果表明：2菌株能强烈抑制灰霉病菌生长,其发酵液也能明显抑制病菌孢子的萌发和生长,且发酵液高温处理后仍具有较高的抑菌活性。在离体黄瓜片上检测菌株对灰霉病菌的抑制效果,结果表明,2菌株发酵液及其细菌悬浮液均能较好地抑制灰霉病菌生长。     

番茄灰霉病菌内生拮抗细菌的筛选及鉴定

以从植物中分离的内生细菌为材料,筛选对番茄灰霉病菌等有拮抗作用的菌株,并对其抑菌活性、抑菌谱进行分析并明确其分类地位。以番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和番茄枯萎病菌等植物病原菌为指示菌,采用平板对峙法和生长速率法对所分离的12株细菌的抑菌活性进行测定,并对具有较好拮抗活性的菌株的抑菌广谱性进行分析。结果表明,所分离菌株中,GZ-5对番茄灰霉病菌的抑制效果最好,GZ-3次之,其发酵液对番茄灰霉病菌FQ-1的抑制率分别可达86.6%,83.0%,且2个菌株对黄瓜灰霉病菌、番茄枯萎病菌等9种病原菌也有较好的拮抗活性;通过对2个菌株形态学观察、生理生化测定及16S r DNA序列分析等,初步将GZ-5菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌,GZ-3菌株为地衣芽孢杆菌。     

贝莱斯芽孢杆菌E69预防稻瘟病等多种真菌病害的潜力

目的 明确水稻内生菌贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株E69对多种植物病原真菌的拮抗作用,尤其是对稻瘟病的生物防治效果,减少化学农药的使用。方法 贝莱斯芽孢杆菌菌株E69和枯草芽孢杆菌（B. subtilis,稻瘟病生物防治最常用微生物）菌株E66分离于水稻叶片内生细菌,采用对峙培养法测试菌株E69和E66及其发酵液、无菌上清液对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的拮抗作用,并测试两株内生芽孢杆菌对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、镰孢菌（Fusarium spp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeospoioides）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、链格孢菌（Alternaria alternate）、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum）等11种植物病原菌的拮抗作用,温室条件下检测对水稻叶瘟的预防效果,田间试验检测对水稻叶瘟和穗颈瘟的预防效果,常规抑菌测试法研究对稻瘟病菌分生孢子萌发和附着胞形成的抑制作用。采用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白标记后的工程菌株E69在水稻茎部的定殖情况。结果 菌株E69和E66对稻瘟病菌菌丝生长具有显著拮抗作用,温室条件下两个菌株对稻瘟病的预防效果分别为83.24%和76.57%,对叶瘟的田间预防效果分别为85.97%和79.76%,对穗颈瘟的田间预防效果分别为69.67%和68.82%,E69对叶瘟的预防效果显著高于75%的三环唑可湿性粉剂,对穗颈瘟的预防效果与三环唑无显著差异。菌株E69和E66对立枯丝核菌、镰孢菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、烟草黑胫病菌、叶枯病菌、西瓜枯萎病菌等11种植物病原菌有显著拮抗作用,E69的拮抗作用明显高于E66。菌株E69和E66能够强烈抑制稻瘟病菌分生孢子萌发和附着胞的形成,E69发酵液的抑菌效果分别为95.28%和94.16%,无菌上清液的抑菌效果分别为85.36%和84.31%;E66发酵液对分生孢子萌发和附着胞形成的抑菌效果分别为89.15%和87.38%,无菌上清液的抑菌效果分别为79.65%和72.45%。绿色荧光蛋白GFP78标记后的工程菌株E69在水稻茎部具有较好的定殖能力,可以稳定定殖在水稻茎部表皮、薄壁组织和维管束。结论 贝莱斯芽孢杆菌菌株E69是一种潜在的、预防效果明显的生防菌株,具有预防稻瘟病兼防纹枯病等多种真菌病害的应用潜力。     

枯草芽孢杆菌X-4对土壤青枯菌消长变化及防病效果的影响

为研究枯草芽孢杆菌X-4在土壤中的定殖动态对青枯菌消长变化的影响,以及对番茄青枯病的防治效果,采用绿色荧光蛋白基因标记法,通过番茄盆栽试验直接测定了其在土壤中的定殖效果及对青枯病病原菌数量、土壤微生物功能多样性及生物量的影响。结果表明,通过绿色荧光蛋白基因标记法能成功跟踪菌株X-4在土壤中的定殖状况,其定殖曲线表现为一非对称抛物线,前期缓慢上升,24 d达到高峰,当接种量为5.0×105、1.0×106CFU/(g土)时,其定殖峰值分别为2.98×107CFU/(g土)和5.03×107CFU/(g土),而青枯菌数量则呈现出与X-4相应的消长变化,处理土壤青枯菌数量在12～30 d时段内呈现下降的趋势,而对照病菌数量处于较高水平并且还有上升趋势,因此未接种菌株X-4处理发病早,病指高;接种微生物菌剂X-4对土壤微生物功能多样性无不利影响,并能有效地抑制病菌,对番茄青枯病表现出明显的防治效果,接种量为1.0×106CFU/(g土)时,35、45、55 d对青枯病的防效分别为100%、83.3%和57.2%;接种X-4还能促进番茄植株生长,增加生物量,促进结果。绿色荧光蛋白标记法可为枯草芽孢杆菌X-4在土壤中的动态变化提供直接的菌量数据,其数量与土壤中青枯菌数量的消长动态对番茄青枯病的防治效果有重要影响。     

拮抗细菌bio-d5在香蕉根部定殖力的测定

将3株香蕉枯萎病拮抗细菌bio-d4、bio-d5和bio-B分别涂布于含有不同浓度的利福平和青霉素的培养基上,筛选出可作为抗药性标记的拮抗细菌bio-d5和bio-B.将抗药性标记的拮抗细菌bio-d5接种于香蕉植株根部,1d后再接种香蕉枯萎病菌,在不同时间测定拮抗细菌在根际、根表和根内的定殖情况.结果显示,将拮抗细菌接种香蕉根部10d后,在植株根际、根表存在少量拮抗细菌,在根内尚未发现拮抗细菌;接种后20d,在植株根际、根表定殖的拮抗细菌增多,根内也定殖了少量的拮抗细菌;在接种后30d,于根表、根际和根内定殖的拮抗细菌量达到最大;在接种后40d,于植株根际、根表和根内定殖的拮抗细菌量稍有下降.     

不同处理方法对内生细菌TS-3在2种蔬菜体内定殖的影响

[目的]了解蔬菜源内生细菌TS-3菌株的生物学效应。[方法]采用涂抹叶片、菌悬液浸种和浇灌3种方法。将利福平（200μg／m1）标记的内生细菌TS-3接种到生菜和甜椒2种蔬菜中,其后测定定殖情况。[结果]采用4×10^5cfu／ml的菌悬液对生菜进行涂抹叶片接种,3d后叶片中菌株数量达到高峰,根中第7天达高峰;在接种甜椒叶片后的第7天,茎和叶中的含菌量均达到最高峰,并稳定在10^4cfu／ml,而根系中舍菌量无明显变化。采用浇灌接种生菜,TS-3菌株在3d后达高峰,在甜椒茎、叶中第9天达高峰,而后该菌的定殖数量稳定在10^4cfu／ml。采用菌悬液浸种,TS-3菌株在生菜叶中的定殖量在1．1×10^4cfu／ml,根中的定殖量在1．5×10^4cfu／ml,而在甜椒中,其定殖量是根〉茎〉叶,但定殖量都在10^4cfu／ml数量级。[结论]鉴于TS-3菌株在2种蔬菜中都能定殖,且不同的接种方法对其定殖量无数量级上的影响,所以采用较简单的浇灌接种方法较好。     

银杏内生拮抗菌株的鉴定及脂肽类物质的活性

为筛选防治草莓灰霉病原菌(Botrytis cinerea)的内生细菌拮抗菌株,采用16SrRNA基因序列同源性分析与平板对峙法相结合研究分离自银杏(Ginkgo biloba)根茎叶的内生细菌拮抗菌株种类及其次级代谢产物的体外抑菌活性。结果表明:分离筛选出7株对草莓灰霉病原菌具有不同程度抑制作用的内生细菌,其中,菌株YJ5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其对草莓灰霉病原菌的抑菌作用较为明显,其脂肽类物质能有效地抑制草莓灰霉病原菌的生长,抑菌带宽15mm。     

生防菌HT3和HT5代谢产物对灰葡萄孢菌的抑菌作用

为了明确从核桃上分离筛选的2株内生菌HT3和HT5的代谢产物对灰葡萄孢菌的抑菌活性及其与农药混配后的抑菌效果,采用孢子萌发法和菌丝生长速率法进行了室内抑菌作用测定。结果表明,菌株HT3和HT5代谢产物对灰葡萄孢菌孢子萌发影响较大,致使孢子畸形或抑制萌发,抑制率分别达到100%和98%;菌株HT3和HT5代谢产物对灰葡萄孢菌菌丝生长也均有显著的抑制效果,其中,菌株HT3代谢产物的抑制率为58.69%,菌株HT5代谢产物的抑制率为63.07%。HT3,HT5代谢产物与杀菌剂速克灵50倍稀释液混配对病原菌菌丝生长的抑制具有一定的增效作用,其中,以速克灵(50倍稀释液)∶HT3=50∶50,速克灵(50倍稀释液)∶HT5=25∶75这2个组合的抑制率较高,分别为87%和86%,增效比均为1.3。     

番茄灰霉病的拮抗菌筛选及分子鉴定

[目的]筛选番茄灰霉病的拮抗菌,并采用分子生物学手段进行鉴定。[方法]以番茄灰霉病病原菌为供试菌,从耕作土壤中筛选拮抗菌,利用平板对峙法对拮抗菌进行初筛和复筛,并通过16S r DNA序列分析对拮抗菌进行鉴定。[结果]从番茄灰霉病发病植株根系土壤中筛选出13个拮抗性能较为稳定的分离物,其中3个菌株对番茄灰霉病菌的拮抗作用较强,抑制率达60.00%以上。结合形态学观察及16S r DNA系统进化树分析,分别鉴定为固氮类芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为番茄灰霉病的生物防治提供理论依据。     

三种生防细菌对新疆灰霉病菌(Botrytis cinerea)的拮抗作用

[目的]明确生防芽孢杆菌A57、A178、N1729在植物病害生物防治中的实用价值,并为后续的生防制剂的研发提供科学依据,对其在新疆各地蔬菜灰霉病菌的抑菌活性进行了研究.[方法]采用平板对峙法检测三种生防细菌抑菌活性,并检测其无细胞滤液的抑菌效果,无细胞滤液利用摇瓶发酵后经微孔滤膜过滤制备,用滤纸片法测定抑菌圈,确定抑菌效果.[结果]A178的活菌体拮抗效果最强,平均抑菌率达45.67;, N1729菌株分泌物的拮抗效果最强,平均抑菌率为44.61;,可作为灰霉病的有效生防菌;而A57的抑菌效果最差,不能作为后灰霉病菌有效的生防菌使用.[结论]A178、N1729这两个菌株具有很好的开发应用前景.     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BH21是一株对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC₅₀;利用高效液相色谱技术（HPLC）对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%-99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%-100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L^-1。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440 μg·mL^-1时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC₅₀为144.39 μg·mL^-1。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400 μg·mL^-1时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220 μg·mL^-1时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。     

黄瓜内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选初报

采用组织分离法,从黄瓜各器官（根、茎、叶）中得到内生细菌173株,其中根中分离得到的最多,占分离总数的42．8％;其次为叶,占32．4％;茎最少,占24．8％。通过平板对峙培养筛选出8株对黄瓜灰霉病菌具有较强拮抗作用的细菌,再对这8株茵发酵滤液的抑茵活性进行测定,选出抑茵效果最好的2个菌株B12和B13,抑制率分别为84．0％和81．8％。     

番茄疫霉根腐病拮抗细菌FC12-05的筛选、鉴定及其抑菌活性初探

【目的】从多年耕作的番茄大棚土壤中筛选对番茄疫霉根腐病有较强生防效果的拮抗细菌。【方法】随机采集多年耕作的番茄大棚土壤样品30份,采用平板稀释法从中分离细菌,以辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、烟草黑胫病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌为靶标菌筛选拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对筛选出的拮抗菌株进行鉴定。检测拮抗菌株无菌发酵液对供试病原真菌菌丝生长、孢子萌发、菌丝形态的影响及对番茄疫霉根腐病的盆栽防效。用饱和度分别为10%,20%,25%,30%,35%,40%,50%,60%,70%,80%,90%和100%硫酸铵对拮抗菌株无菌发酵液进行沉淀,测定不同饱和度硫酸铵沉淀物的抑菌活性。【结果】从采集的30份土壤样品中分离得到253株细菌,经病原真菌定向筛选后,得到1株对辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、烟草黑胫病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌、稻瘟病菌有较强生防效果的细菌FC12-05,经鉴定FC12-05为西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。FC12-05菌株无菌发酵液对辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制效果较好,菌丝生长抑制率分别为95.02%和92.43%,EC₅₀分别为10.14和10.78 mL/L;对抑制辣椒疫霉病菌和番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制率分别为94.60%和92.45%,EC₅₀分别为2.09和2.53 mL/L;对番茄疫霉根腐病的盆栽防治效果高达93.50%。在硫酸铵饱和度为10%～25%时,获得的抑菌物质对辣椒疫霉病菌均有抑菌活性,其中硫酸铵饱和度为20%时获得的抑菌物质对辣椒疫霉病的抑菌活性较高,抑菌圈直径达19.33 mm;硫酸铵饱和度≥30%时,无沉淀析出,对辣椒疫霉病菌无抑菌活性。【结论】筛选到的拮抗细菌FC12-05对番茄疫霉根腐病有较强的生防效果,能显著抑制番茄疫霉根腐病菌的生长。     

番茄灰霉病拮抗细菌的筛选

采集番茄土壤、根、叶片和花样本共96份,经平板法和叶盘法两步分离,获得对番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)有抑制作用的拮抗细菌12株。根据抑菌圈法测定,拮抗细菌对灰霉菌的拮抗能力有显著差异,其中B21菌株抑菌圈直径达35mm,拮抗性最强最稳定。温室试验表明:B21悬浮液和10倍稀释液对番茄灰霉病有较好的防治效果,室内叶片的防效分别为98.68%和98.03%,无显著差异,明显优于45%多菌灵(500倍稀释液)。     

芽孢杆菌B21菌株及其发酵液对番茄灰霉菌C31的影响

利用组织透明法、叶盘法、平皿法和对峙生长法，观察了芽孢杆菌菌株B21及其发酵液对灰霉菌C31生长的影响。结果，灰霉菌菌株C31分生孢子的萌发和菌丝生长均受到明显的抑制。芽孢杆菌B21及其发酵液可导致灰霉菌C31菌丝变形，细胞壁破裂，细胞内容物流出。