低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况.结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大.研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关.     

刺参4个功能基因的表达分析

为研究刺参Apostichopus japonicus的生长发育,采用实时定量PCR方法,对刺参腱生蛋白基因、胶原蛋白α2基因、整合蛋白αV基因和整合蛋白βL基因等4个候选功能基因不同月龄的组织表达进行了分析。结果表明:刺参12、13、14月龄时,腱生蛋白基因在刺参肠、管足、呼吸树、皮肤、体壁、体腔液细胞、疣足和纵肌等8个组织中均有不同程度的表达,其中在体腔液细胞和呼吸树组织中的表达量较高(P0.05);胶原蛋白α2基因在刺参管足、呼吸树、体壁、疣足和纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加,其中在呼吸树组织中表达量最高,在纵肌、疣足、体壁、肠和体腔液细胞等组织中的表达量逐渐降低;整合蛋白αV基因在纵肌组织中的表达量随月龄的增加而逐渐增加;整合蛋白βL基因在皮肤、体壁、疣足和管足组织中的表达量较低。本研究结果为深入研究刺参这4个功能基因提供了参考。     

仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

刺参26S蛋白酶体S7亚基基因的克隆与组织表达分析

应用RACE法从刺参Apostichopus japonicus体腔细胞中克隆出26S蛋白酶体组成19S亚复合体亚基之一的S7亚基基因(GenBank登录号:JQ922514)。该基因的cDNA序列全长为2 445 bp,其中5’UTR为70bp,3’UTR为1 070 bp,开放阅读框为1 305 bp,编码435个氨基酸;保守区具有典型的ATP结合和水解基序,氨基酸序列分别为GPPGTGKT和DEID,具有MAT和VRPGRLDR的RNA/DNA螺旋酶的特征性基序;刺参26S蛋白酶体S7亚基基因与紫海胆的氨基酸序列同源性最高(95%),与脊椎动物、节肢动物的同源性较高(88%~89%),与线虫、拟南芥和酵母同源性较低(85%、77%和73%);S7亚基编码的蛋白没有信号肽,也没有跨膜结构域,为非跨膜蛋白,定位于细胞中的液态基质中。采用实时定量PCR方法检测了26S蛋白酶体S7亚基基因在刺参5种组织中的表达情况,结果显示,在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中26S蛋白酶体S7基因均有明显表达,且体腔细胞中表达量最高,其次是纵肌和肠,在体壁和呼吸树中表达量较低。本研究中首次在刺参体内发现并克隆了26S蛋白酶体S7亚基基因,同时采用Realtime PCR技术对该基因的表达部位进行了研究,所得结果将为研究棘皮动物蛋白质代谢途径提供新的着眼点,为刺参生理功能的调控研究奠定了基础。     

仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析

仿刺参（Apostichopus japonicus）是我国北方沿海重要养殖品种之一。克隆了仿刺参profilin基因全长cDNA序列,并分析了基因的表达规律。该基因cDNA序列全长787 bp,5′-非翻译区（5′-untranslated region,UTR）长205 bp,3′-UTR长204 bp,开放阅读框378 bp,编码125个氨基酸,预测蛋白分子量13.4 kDa。仿刺参Profilin蛋白的PROF保守结构域中含有肌动蛋白互作位点、多聚脯氨酸结合位点和PIP2互作位点。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Profilin与丝盘虫（Trichoplax adhaerens）和囊舌虫（Saccoglossus kowalevskii）相似度最高,为46%。Quantitative real-time PCR结果显示,profilin mRNA在仿刺参未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体和稚参11个发育阶段及幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中均有表达;在仿刺参的不同发育阶段中,未受精卵至原肠期profilin mRNA表达量低,从小耳状幼体至稚参表达量增高;在仿刺参的不同组织中,profilin mRNA在体腔细胞中的表达量最高。经过棘皮动物免疫系统有效激活物脂多糖LPS的刺激,体腔细胞中profilin mRNA表达量显著升高,为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。     

刺参温度相关基因在模拟不同海域冬春季水温条件下的表达研究

为探讨不同海域冬春季水温对刺参温度相关基因的表达影响,在实验室内模拟了俄罗斯沿海地区、大连沿海地区、福建沿海地区12月至翌年4月刺参Apostichopus japonicus生长的海水温度,并从已构建的刺参耐寒基因筛选cDNA文库和刺参高温胁迫正反消减cDNA文库中选取了7个差异基因:hsp70、gp96、UQCRFS1、ferritin、lysozyme、mtLSU、proeintl(2)efl,利用实时荧光定量PCR方法研究了这7个基因在3种海域冬春季模拟水温条件下的表达情况。结果表明:3个水温组刺参同一组织中hsp70基因的表达量变化不明显,但在不同组织中的表达量存在差异;模拟福建沿海地区冬春季水温组刺参各组织中gp96基因的表达量整体上均高于其他两个水温组,并且在模拟福建沿海地区冬春季水温组刺参呼吸树中的表达量显著高于该组肠和体壁(P0.05);模拟俄罗斯沿海地区冬春季水温组刺参各组织中UQCRFS1基因的表达量均高于其他两个水温组;3个水温组刺参各组织中ferritin基因的表达模式及表达量均不相同;3个水温组刺参各组织中lysozyme和proeintl(2)efl两个基因的表达量均在呼吸树中达到最高,且显著高于肠和体壁(P0.05);3个水温组刺参各组织中mt LSU基因的表达模式基本相同,其表达量均表现为体壁显著高于肠和呼吸树(P0.05)。     

盐度胁迫对刺参非特异性免疫酶的影响

盐胁迫后刺参的行为表现及免疫酶活性会发生相应变化,以达到适应盐度变化的目的。设定5个盐度梯度(18、23、33、36和40),分析盐度胁迫后刺参行为变化及不同响应时间下体腔液中碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LSZ）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力变化。实验结果发现盐度增加和降低都使刺参的活动受到影响,低盐度胁迫比高盐度胁迫对刺参的影响大。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性总体呈现先降低后升高,随着时间的延长逐渐恢复适应的趋势。盐度23溶菌酶活力显著高于盐度32的对照组;盐度为36时,溶菌酶活力在第1天最高,随后降低,维持2 d后,酶活力又开始升高,并高于盐度32的对照组水平;盐度为18、40时,酶活力显著低于对照组,并一直维持在较低水平。低盐18、23胁迫时,超氧化物歧化酶SOD酶活力明显低于对照组,且最低点均出现在第8 d。高盐36、40胁迫时,酶活力明显高于对照组,最高点分别出现在第5 d和第8 d。研究结果为刺参机体在盐度胁迫下的调节适应机制研究工作奠定一定的基础。     

几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响

测定了仿刺参Apostichopus japonicus 体腔液补体溶血活性,并研究了几种理化因子对仿刺参体腔液补体溶血活性的影响.结果表明:仿刺参体腔液补体溶血活性为(68.8±13.5) U/mL;仿刺参体腔液在pH为7.5、Mg2+浓度为8 mmol/L的EGTA-Mg-GVB缓冲液和20 ℃条件下恒温水浴90 min时,其溶血活性最高;Mg2+对仿刺参体腔液补体的溶血活性有影响,苯甲基磺酰氟(PMSF)、酵母聚糖、甲胺和肼对仿刺参补体旁路溶血活性均有明显的抑制作用.     

脯氨酸对缢蛏高盐耐受性的影响

脯氨酸是生物体内重要的有机调节物质,对海洋贝类适应盐度变化具有重要影响。为了研究脯氨酸对缢蛏(Sinonovacula constricta)高盐耐受性的影响,本实验对缢蛏进行高盐(32)胁迫,并在高盐条件下添加外源氨基酸,对比不同条件处理下缢蛏脯氨酸含量、可溶性蛋白含量以及脯氨酸转运基因表达水平。高盐胁迫下,三种游离氨基酸显著上升(P<0.05),其中,脯氨酸含量积累最多,并始终处于高水平合成状态(P<0.05)；可溶性蛋白含量显著降低、排氨率升高；脯氨酸转运基因SLC6A7-1和SLC6A7-2表达显著上升。当添加外源脯氨酸后,脯氨酸含量积累更多,在72h时达到了峰值；可溶性蛋白含量开始显著增加,排氨水平显著下降(P<0.05)；脯氨酸转运基因SLC6A7-1表达先上升后下降,而SLC6A7-2一直处于高表达状态,在24h时表达量达到峰值。结果表明,脯氨酸可以促进缢蛏体内大分子蛋白合成,为缢蛏高盐适应性生存提供更多能量,为深入探究脯氨酸调控海洋贝类高盐适应性提供了重要理论依据。     

仿刺参体腔细胞单克隆抗体的制备及特性分析

应用杂交瘤技术制备了4株稳定分泌抗仿刺参Apostichopus japonicus体腔细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其单克隆抗体的特性进行了分析。结果表明：单抗1C7和1H7主要结合淋巴样细胞,单抗2E8可与所有体腔细胞结合,单抗4E9主要结合球形细胞;单抗2E8、4E9与仿刺参体腔液具有明显的交叉反应,单抗1C7和1H7则与体腔液无交叉反应;单抗1C7和4E9属于IgG1,2E8属于IgG2a,1H7属于IgM亚型;单抗1C7和1H7均可识别相对分子质量为37 000的蛋白,单抗2E8可同时识别相对分子质量为37 000和61 000两种蛋白,单抗4E9可识别相对分子质量为108 000的蛋白。该单抗的制备为进一步研究仿刺参体腔细胞和体腔液之间的关系,体腔细胞的分类、分布、发生、分化及功能提供了新的工具。     

急性盐度胁迫对紫石房蛤(Saxidomus purpurata)鳃组织结构及4种酶活性的影响

为探明急性盐度胁迫对狭盐性贝类紫石房蛤(Saxidomus purpurata)组织形态结构及生理生化的影响,研究了急性高盐(盐度35)和低盐(盐度15)胁迫下紫石房蛤鳃组织显微结构、Na+/K+-ATP酶和体腔液、鳃组织中SOD、CAT和POD 3种非特异性免疫因子的变化。鳃组织结构变化结果显示,与自然海水对照组相比,急性盐度胁迫实验组紫石房蛤鳃丝间距均呈现显著差异。盐度胁迫3 h起,低盐胁迫组紫石房蛤鳃丝皱缩程度和鳃间距与自然海水组相比总体呈现随胁迫时间增加而增大的趋势;高盐胁迫组鳃丝则表现为先皱缩后饱满,鳃间距呈逐渐缩小后逐步增大的趋势;低盐胁迫各时间点,鳃丝形态结构变化较相对应的高盐胁迫组明显。紫石房蛤鳃组织Na+/K+-ATP酶在急性低盐胁迫下活力升高,急性高盐胁迫下活力降低。24 h低盐和高盐度急性胁迫对紫石房蛤SOD、CAT和POD酶活力的影响呈现组织特异性。体腔液中以SOD率先对盐度胁迫产生应答,鳃组织中则以POD的响应最为快速。急性高盐胁迫下紫石房蛤体腔液中SOD和CAT活力在胁迫1 h、3 h后无明显变化,胁迫5 h后显著上升;胁迫7 h后显著下降;胁迫24 h后又显著上升,变化趋于一致(P0.05)。急性低盐胁迫下紫石房蛤体腔液中CAT和POD酶活力分别在7 h和3 h显著下降至最低点,之后逐步趋于对照组水平(P0.05)。结果提示,急性盐度胁迫下紫石房蛤体腔液和鳃组织中SOD、CAT和POD 3种非特异性免疫因子及鳃组织中Na+/K+-ATP酶的响应方式不同,紫石房蛤可能通过改变鳃组织形态结构从而适应外界盐度的骤然变化。     

急性盐度胁迫对光裸星虫渗透压和超氧化物歧化酶活性的影响

[目的]探讨盐度胁迫对光裸星虫体腔液渗透压及超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。[方法]对光裸星虫进行不同盐度急性胁迫48 h,用渗透压仪检测所有样品渗透压,采用羟胺法检测48 h所取部分样品的超氧化物歧化酶(SOD)活性。[结果]从暂养盐度30‰中移到盐度5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰和40‰海水中时,48 h内光裸星虫体腔液渗透压均能调节到一定的稳定状态,且与水环境渗透压相近;达到相近水平所需时间分别为15、15、9、6、6、0、6和9 h,随盐度的升高呈先降低后升高的趋势。在盐度15‰～40‰的梯度中,星虫体腔液SOD活性整体上随盐度的升高呈现先下降再上升的趋势,其中盐度25‰与盐度30‰组的光裸星虫SOD活性差异不显著(P0.05),但均显著低于其他组(P0.05)。[结论]在急性胁迫下,较适合光裸星虫生存生长的盐度为15‰～40‰,最适合的盐度为25‰～30‰。     

盐胁迫条件下不同草种耐盐碱表现

观察无芒雀麦、交战Ⅱ、翠碧A、小野马、回报五个品种草种在天津盐碱土浸提液胁迫条件下的生长状况,并通过分析其不同部位的生物量、含水量等有关生理指标的变化与抗盐性间的关系,分析其抗盐能力的大小。结果表明,5个草种都有一定的抗盐能力,抗盐碱能力大小依次为:无芒雀麦、回报、交战Ⅱ、小野马、翠碧A。     

15个草地早熟禾品种（系）萌发期对盐胁迫的抗性研究

针对草地早熟禾品种（系）萌发期对盐分最敏感的特点,对15个草地早熟禾品种（系）在不同盐浓度胁迫下的萌发特性进行研究,测定其发芽率、发芽势和相对盐害率等的变化情况,结果显示031315草地早熟禾和031322草地早熟禾2个品系用0.8%NaCl胁迫时的发芽率都在35%以上,即这2个品系萌发期的耐盐胁迫能力较强。     

根际盐分差异性分布对高粱幼苗生长发育的影响

【目的】盐碱地盐分含量在土壤表层的分布通常是不均匀的,研究不均匀盐胁迫条件下高粱幼苗生长发育和生理生化指标的变化,可为盐碱地高粱栽培和盐碱地高效开发利用提供理论依据。【方法】 利用分根法将高粱根系均匀分成2部分,并分别置于不同浓度（mmol·L ^-1）NaCl中,设置对照为无盐胁迫（记作0/0,下同）、不均匀盐处理（0/200、50/150）和均匀盐处理（100/100）,在人工气候室培养14 d后取样,测量生物量、叶面积、SPAD值、根系形态、渗透调节物质、抗氧化酶活性和光合参数等性状,研究分根盐胁迫条件下高粱生长发育的变化规律。 【结果】 不均匀盐胁迫和均匀盐胁迫均严重影响了高粱幼苗的生长发育,显著降低了高粱幼苗鲜重、干重和叶面积,对叶片的光合能力、抗氧化酶活性和渗透调节物质均有一定程度的影响。然而,不均匀盐处理50/150和0/200的单株干重比均匀盐处理提高了21.19%和62.71%,单株鲜重提高了35.39%和86.44%,叶面积提高了13.22%和88.66%;50/150处理低盐一侧根系鲜重和干重分别是高盐一侧的1.90倍和2.10倍,0/200处理无盐一侧根系鲜重和干重分别是盐胁迫一侧的3.02倍和3.75倍。同样,不均匀盐处理对局部根系形态影响显著,低盐或无盐一侧根系生长明显增加,50/150和0/200处理低盐一侧的根系长度、根系体积、根尖数和分支数显著高于高盐或有盐胁迫一侧根系,进而不均匀盐胁迫条件下整个根系的根系长度、根系体积、根尖数和分支数都高于均匀盐胁迫处理,其中0/200处理的各项指标与均匀盐处理差异均达到显著性水平（P<0.05）。叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性在不均匀盐胁迫条件下显著升高（P<0.05）;不均匀盐处理的叶片渗透调节性物质脯氨酸（PRO）和可溶性糖（SS）含量显著高于均匀盐处理,丙二醛（MDA）含量显著下降（P<0.05）。不均匀盐处理条件下植株光合能力相对于均匀盐处理也得到显著改善,主要体现在显著升高的光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）;相较于均匀盐处理,在不均匀盐处理条件下50/150、0/200的荧光参数实际光化学效率（ΦPSⅡ）、最大光化学效率（Fv/Fm）和电子传递效率（ETR）分别提高了5.64%和19.00%、9.25%和18.89%、1.93%和6.89%,其中0/200处理的ΦPSⅡ和Fv/Fm与100/100处理的差异达到显著性水平（P<0.05）。【结论】 不均匀盐处理和均匀盐处理对高粱幼苗生长均产生抑制,但在不均匀盐胁迫条件下,由于低盐或无盐一侧根系补偿性增长,整个根系形态得到改善,叶片抗氧化酶活性、渗透调节能力和光合能力均有一定程度提高,因而缓解盐胁迫对高粱幼苗的危害。     

高粱品种萌发期耐盐性筛选与鉴定

【目的】根据不同高粱品种萌发期对盐胁迫的响应,筛选出适合在盐渍土壤上种植的高粱品种及为耐盐胁迫人工调控提供依据。【方法】采用人工气候箱内培养皿培养,用150 mmol•L-1NaCl对42个高粱品种进行胁迫处理,蒸馏水处理为对照,每培养皿放30粒种子。人工气候箱内湿度60%,光照/黑暗时间为12h/12h,光照强度为134 μmol•m-2•s-1,昼/夜温度为28℃/25℃。培养第4天测定发芽势,第10天测定发芽率、根长、叶长、根重、叶重。通过主成分分析、聚类分析和对各品种的表现综合评定,对高粱品种进行耐盐性强弱的分类。【结果】多项萌发和生长参数的相对值之间存在着极显著或显著的正相关。主成分分析结果表明,根长、叶重和发芽率分别在根部、叶部和萌发因子中的负荷量最大,可作为萌发期高粱耐盐性筛选的主要鉴定指标。42个高粱品种的耐盐性存在很大差异,其中辽杂15等5个品种为高度耐盐品种,沈试104等14个品种为耐盐品种,敖杂1等12个品种为中等耐盐品种,铁杂17等8个品种为盐敏感品种,龙杂10等3个品种为高度盐敏感品种。【结论】150 mmol•L-1NaCl可作为高粱萌发期耐盐性鉴定的适宜盐浓度,根长、叶重和发芽率等指标可用于大批量高粱品种耐盐性的评价。     

盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响

为研究盐度对仿刺参(Apostichopus japonicus)蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响,通过考马斯亮蓝G250染色法间接测定仿刺参蛋白摄入量,福林-酚法测定仿刺参消化道蛋白酶活力。结果表明,在盐度为3.1%时,仿刺参蛋白摄入量最多,消化道蛋白酶活力最强;在盐度2.5%~3.1%范围内,随着盐度的升高,仿刺参蛋白摄入量和消化道蛋白酶活力逐渐升高;在3.1%~3.4%范围内,随着盐度升高,仿刺参蛋白摄入量和消化道酶活力均下降。盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响明显。     

碱茅的耐盐限度试验

宜于盐碱地生长的禾本科牧草——碱茅,在氯化物—硫酸盐盐土区经砂培和土培试验得出:种子发芽和生长时的耐盐性能有一定限度,当土壤盐分浓度低于0.563％时发芽基本正常;浓度在0.563～1.125％时发芽受到抑制,高于1.125％时种子受到严重盐害;浓度达2.25％时,种子中毒,基本上全部腐烂,不能发芽;土壤盐分浓度达0.529％时碱茅能正常生长,高于0.529％时生长受到抑制;浓度达1％时生长受到盐害,生物量仅为对照的五分之一。     

高粱耐盐分子生物学研究进展

盐害是影响植物生长和作物产量的主要因子之一,通过遗传改良提高植物的耐盐性是简单有效解决盐害的主要途径。综述了到目前为止筛选鉴定出的主要耐盐碱资源;耐盐碱基因（数量性状位点）的定位、克隆及通过基因工程技术进行耐盐基因在不同作物中的转移利用情况;并对高粱耐盐碱的研究前景进行了展望。以期为高粱等作物的耐盐碱改良研究提供理论依据,从而促进对土壤盐渍化影响农作物产量和质量的重大农业问题的解决。