基于ITS2和SNP技术鉴定浙江铁皮石斛的初步研究

铁皮石斛以营养价值和保健功效备受消费者青睐,但不同品种和不同品质铁皮石斛的区分和鉴别存在困难,急需建立一种快捷、准确、高效的鉴定方法。以浙江省12个铁皮石斛和其他省的10个石斛为材料,选取DNA条形码ITS2,优化扩增体系,对扩增产物进行测序,经序列比对与分析,获取浙江铁皮石斛DNA条形码ITS2中的特异性SNP位点;针对位点设计特异性引物进行了PCR验证,同时建立了基于高分辨率熔解曲线(HRM)技术对SNP位点的快速鉴别方法。研究结果表明,DNA条形码ITS2能较好地区分铁皮石斛与其他石斛,而铁皮石斛的ITS2序列中存在SNP位点,基于SNP的快速检测实现对铁皮石斛的快速鉴别,为铁皮石斛的鉴别和质量控制提供了新的理念和技术路径。     

5种DNA条形码在苍耳属中遗传距离比较

比较了5种DNA条形码的重点关注基因psbA-trnH、ITS、ITS2、rbcL、matK在苍耳属中的遗传距离,以期为植物DNA条形码标准基因的筛选研究提供参考。用通用引物对7种苍耳属植物的psbA-trnH、ITS、ITS2、rbcL、matK基因进行扩增、测序,利用MEGA 5.1软件计算遗传距离及标准误。结果表明:ITS2、ITS、matK、psbA-trnH、rbcL基因在苍耳属中的遗传距离依次减小;ITS2、psbA-trnH、ITS、matK、rbcL基因在苍耳属中的遗传距离标准误依次减小。因此从苍耳属的植物层面看,ITS基因作为植物DNA条形码要比ITS2基因具有更好的稳定性;作为植物DNA条形码,matK基因要优于psbA-trnH基因。     

基于ITS2条形码对龙虎山野生石斛资源的研究

铁皮石斛是我国名贵中草药之一,位列"中华九大仙草"之首。选取江西龙虎山铁皮石斛样品中的31株样本进行品种鉴定,采用DNA条形码对31株样本进行ITS2序列分析,利用软件MEGA6.0对筛选得到的31个ITS2序列进行遗传距离的测定和进化树的构建,确定其之间的亲缘关系,发现其中有6个品种为龙虎山特有品种,就此建立起江西龙虎山铁皮石斛资源库,为保护江西优质的石斛资源奠定理论基础。     

不同来源铁皮石斛多糖积累相关基因表达差异研究

铁皮石斛为我国传统名贵中药材,具有很高的药用价值。其主要的药用活性物质是多糖,由于多糖结构、组分复杂,目前集中于多糖合成相关酶的研究。本研究通过荧光定量分析,分析了来自广东、浙江、福建、云南和贵州五省的铁皮石斛4个多糖合成相关基因(UGPase、PEPC、β-1,3-GS、DoNI)的表达量及与多糖含量的相关性。结果表明:在所检测的样品中,β-1,3-GS基因的表达量最高,且存在地区差异性;来自福建、浙江地区的铁皮石斛样品中,多糖含量较高,分别达到34.04%和33.88%;关联分析表明:UGPase基因、β-1,3-GS基因和DONI基因表达量与多糖含量成正相关,而PEPC基因则刚好相反。本研究结果可为探索快速检测铁皮石斛多糖含量提供多个候选基因及理论依据。     

铁皮石斛品质性状影响因子的研究进展

铁皮石斛是我国国家二级保护植物濒危中药材之一,随着组织培养和大棚栽培等人工栽培技术的发展,其人工栽培面积也逐年增大,但市面上铁皮石斛的种内变异类型混乱,品质良莠不齐,因而了解铁皮石斛品质性状影响因子、保障铁皮石斛的品质是目前研究的重点。本文总结了铁皮石斛遗传因素对其品质的影响,评述了铁皮石斛功能基因的研究现状,综述了不同光照、温度、湿度、基质、肥料和栽培方式等对铁皮石斛品质性状的影响。分析表明,铁皮石斛的品质性状受遗传因子、生态环境因子和栽培方式等诸多因素的影响,且各因素对铁皮石斛品质产生的效应各不相同,单纯改良某一因素都不能从根本上解决铁皮石斛品质良莠不齐的问题。因此,建议严把铁皮石斛高品质品种选育关、严把铁皮石斛人工栽培技术关、严把铁皮石斛高品质生产技术关,进行系统性的综合改良。     

DNA条形码基因ITS·ITS2及rbcL在苍耳属可采用相同的PCR条件

[目的]为植物DNA条形码标准基因筛选研究提供参考,减少植物DNA条形码研究中的工作量。[方法]对7种苍耳属植物ITS、ITS2及rbcL基因采用相同的扩增条件(95℃4 min;94℃30 s,52℃45 s,72℃45 s,35个循环;72℃10 min,4℃保存)。[结果]3种DNA条形码基因同时成功扩增。[结论]这说明植物DNA条形码基因中ITS、ITS2及rbcL的PCR条件存在合并可能性。     

DNA条形码基因ITS·ITS2及rbcL在苍耳属可采用相同的PCR条件（英文）

[目的]为植物DNA条形码标准基因筛选研究提供参考,减少植物DNA条形码研究中的工作量。[方法]对7种苍耳属植物ITS、ITS2及rbcL基因采用相同的扩增条件（95℃4 min;[35 cycles：94℃30 s;52℃45 s;72℃45 s];72℃10 min;4℃保存）。[结果]3种DNA条形码基因同时成功扩增。[结论]这说明植物DNA条形码基因中ITS、ITS2及rbcL的PCR条件存在合并可能性。     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础.[方法]采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平.[结果]铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05.铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右.该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白.CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CH基因的表达量降低,茎中的表达量升高.[结论]铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成.     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

基于ITS2和rbcL序列石斛属植物的鉴定

为选育优质石斛品种和开发利用高效药用石斛资源,利用形态学分类法和DNA条形码技术对采集到的石斛样品进行鉴定,并对样品ITS2序列二级结构进行分析。结果表明:样品形态与石斛属植物特征相似。以ITS2序列构建系统发育树,样品GX07与Dendrobium loddigesii,YN08与Dendrobium officinale位于同一位置,其二级结构也基本一致,螺旋区和茎环等结构均无明显区别。基于rbcL序列构建的系统发育树没有达到很好的分辨效果,石斛属种间遗传距离最大为0.028。表明ITS2比rbcL更适合石斛属种间物种鉴定,并且其二级结构具有一定的辅助作用。     

铁皮石斛种质资源研究进展

铁皮石斛是云南省重要的药用植物之一,为了更好地开发和利用铁皮石斛种质资源,本文综述了铁皮石斛种质资源的研究进展,探讨了云南省铁皮石斛开发和利用中存在的问题,并提出了今后需要重点研究的方向。旨在进一步推动云南省铁皮石斛种质资源的深入研究与合理开发利用。     

超微技术对铁皮石斛粗多糖浸出的影响

通过苯酚-硫酸法测定铁皮石斛超微粉与铁皮石斛常规粉水溶性粗多糖的含量,探讨超微技术对铁皮石斛粗多糖浸出的影响。结果表明,铁皮石斛超微粉中水溶性粗多糖含量为484.6 mg/g,常规粉水溶性粗多糖含量为370.2 mg/g,铁皮石斛超微粉水溶性粗多糖含量比常规粉水溶性粗多糖含量高30.9%,二者的差异具有统计学意义(P<0.05)。超微技术有助于铁皮石斛粗多糖的浸出。     

铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量研究

以软脚红杆铁皮石斛为实验材料,参考《中国药典》（I部）标准,对其原球茎、丛生芽、瓶苗茎、炼苗茎和鲜条进行多糖和甘露糖含量的检测。结果表明：（1）软脚红杆铁皮石斛不同阶段多糖和甘露糖含量都达到了中国药典的标准。（2）软脚红杆铁皮石斛植株在不同生长阶段,多糖和甘露糖含量差异较小。（3）人工组培的石斛不同阶段中,都含有丰富的多糖和甘露糖,具有较高的营养价值;原球茎与鲜条的多糖和甘露糖含量差异虽然不大,但与鲜条相比,具有生长时间短、简单易得等优势。（4）在当今野生铁皮石斛紧缺的情况下,通过组培方式获得的铁皮石斛原球茎和丛生芽,可以弥补野生铁皮石斛资源不足的问题。     

石斛抗氧化和滋阴作用的试验研究

[目的]研究金钗石斛、鼓槌石斛和铁皮石斛的抗氧化和滋阴药效异同,为其临床用药提供一定的科学依据。[方法]采用DPPH.清除率检测法评价其体外抗氧化活性;并采用氢化可的松建立阴虚大鼠模型,用试剂盒法测定血清中的超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和乳酸脱氢酶(LDH)的活力,并计算大鼠体重、进食量以及死亡率,评价石斛滋阴效果。[结果]体外抗氧化试验表明,3种石斛的抗氧化作用强弱为:铁皮石斛鼓槌石斛金钗石斛,铁皮石斛与鼓槌石斛抗氧化活性和Vc接近,金钗石斛次之;浙江产铁皮石斛和云南产鼓槌石斛抗氧化效果相当,均优于其他产地的。滋阴试验结果表明,铁皮石斛和鼓槌石斛滋阴作用等同,金钗石斛次之。[结论]铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛抗氧化和滋阴有差异,在临床使用时可有选择的使用。     

不同有机肥对铁皮石斛生长、产量及多糖含量的影响

以嘟乔山种和广南种铁皮石斛为材料,研究了施用不同有机肥对铁皮石斛植株生长、栽培产量及植株多糖含量的影响。结果表明:施用有机肥能够促进铁皮石斛植株生长,提高栽培产量,但不利于铁皮石斛植株多糖积累;嘟乔山种铁皮石斛施用发酵花生麸有机肥能够获得较高的栽培产量和品质,栽培产量比对照提高58.8%,多糖含量比对照下降0.2%;广南种铁皮石斛施用发酵混合料有机肥(牛粪+羊粪+花生麸,各1/3)能够获得较高的栽培产量和品质,栽培产量比对照提高70.2%,多糖含量比对照下降0.8%。     

铁皮石斛菌根真菌对铁皮石斛组培苗的接种效应

[目的]对铁皮石斛（Dendrobium officinale）菌根真菌对铁皮石斛组培苗的接种效应进行研究。[方法]以从野生铁皮石斛根系中分离得到的Tjl、Tj2、Tj3真菌为材料,将其接种到铁皮石斛组培苗的根系上进行接种试验。[结果]在组培条件下,Tjl菌在前期没有表现出促生作用,Tj2菌表现出较强的促生作用,Tj3菌则对根具有促生作用,而在后期,Tj1菌则表现出了较强的促生作用,Tj2菌的接种效果最好,促生作用最强,Tj3菌则出现烂根烂苗现象;在室外条件下,Tj2菌接种使组培苗叶数增加,侧芽数增加,侧根生长明显,株高增加显著,叶片大而深绿,根部有明显的膨大现象。[结论]2种接种方式均说明Tj2菌对铁皮石斛的地上植株和地下根系生长,株数增多,株高增加,新芽和新根萌发均具有较强的促进作用,证明Tj2菌与铁皮石斛有效地建立了共生关系。因此Tj2菌对石斛组培苗的成功栽培具有实际应用价值。     

铁皮石斛菌根真菌对铁皮石斛组培苗的接种效应

[目的]对铁皮石斛（Dendrobium officinale）菌根真菌对铁皮石斛组培苗的接种效应进行研究。[方法]以从野生铁皮石斛根系中分离得到的Tj1、Tj2、Tj3真菌为材料,将其接种到铁皮石斛组培苗的根系上进行接种试验。[结果]在组培条件下,Tj1菌在前期没有表现出促生作用,Tj2菌表现出较强的促生作用,Tj3菌则对根具有促生作用,而在后期,Tj1菌则表现出了较强的促生作用,Tj2菌的接种效果最好,促生作用最强,Tj3菌则出现烂根烂苗现象;在室外条件下,Tj2菌接种使组培苗叶数增加,侧芽数增加,侧根生长明显,株高增加显著,叶片大而深绿,根部有明显的膨大现象。[结论]2种接种方式均说明Tj2菌对铁皮石斛的地上植株和地下根系生长,株数增多,株高增加,新芽和新根萌发均具有较强的促进作用,证明Tj2菌与铁皮石斛有效地建立了共生关系。因此Tj2菌对石斛组培苗的成功栽培具有实际应用价值。     

铁皮石斛茶的研制

为了促进珍稀药材铁皮石斛新产品的开发,试验通过测定铁皮石斛组培苗的多糖含量,选取长度为2~4 cm的铁皮石斛组培苗（多糖含量9.15%）作为铁皮石斛茶的制作原料;同时,参考绿茶加工工艺,对铁皮石斛茶制作的各关键工序进行了研究。结果表明,采用室内自然摊放、微波杀青以及手工炒制和烘箱烘干相结合的干燥方式制作的铁皮石斛茶,叶片外形卷曲、色泽嫩黄,内质汤色黄绿,香气清香,滋味回甘,无苦涩味,叶底嫩绿明亮。     

两种石斛多糖的抑菌作用研究

[目的]探讨铁皮石斛多糖和金耳石斛多糖在体外对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用。[方法]采用滤纸片抑菌圈法研究2种石斛多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用。[结果]铁皮石斛多糖对大肠杆菌抑制作用最强,最小抑菌浓度（MIC）为0.5%,抑菌圈直径为15.8 mm;金耳石斛多糖对枯草芽孢杆菌抑制作用最强,MIC为0.5%,抑菌圈直径为12.8 mm。[结论]体外条件下,铁皮石斛多糖对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有抑制作用,但对金黄色葡萄球菌无抑制作用;金耳石斛多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌均有抑制作用。