枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX生物信息学分析及植物表达载体的构建

利用生物信息学软件对已获得的枣树抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA序列ZjAPX进行了同源性及功能位点等多项参数分析。结果表明,此序列为全长753 bp的开放读码框(ORF),编码251氨基酸,分子量为62.55 kDa,理论等电点为5.10,为一个膜外蛋白;序列保守性分析表明,该序列具有典型的铁氧化还原蛋白结合区域,属于一个典型的植物亚铁血红素过氧化物酶家族蛋白;氨基酸序列相似性分析表明,该蛋白与已知的其他植物抗坏血酸过氧化物酶APX具有极高的同源性,与可可树APX和陆地棉APX同源性均为93%,命名为ZjAPX(DDBJ/EMBL/GenBank注册号:AB608053)。用Swiss Model程序(http://au.expasy.org/tools/)推测了ZjAPX基因编码蛋白的三维结构。以ZjAPX的cDNA序列为模板,PCR扩增后,经限制性内切酶消化,与PEZR(K)-LNY载体进行重组连接,测序结果显示,其植物表达载体构建成功。此结果为研究枣树抗坏血酸过氧化物酶基因在植物体内的生物学功能以及可能的活性调节方式奠定了基础。     

山荆子CBF转录因子的克隆、序列分析及植物表达载体的构建

利用RT-PCR技术从山荆子cDNA中克隆CBF基因,ORF全长756 bp,编码252个氨基酸;其氨基酸序列含典型的CBF基因蛋白保守的序列AP2/EREB DNA结合域及CBF家族蛋白特征短多肽序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR);与Genebank上收录的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对,结果发现山荆子CBF转录因子MbCBF和苹果CBF/DREB1基因的氨基酸序列相似性为98%;与梅树CBF相似性为67%;进一步构建了植物表达载体,为利用CBF基因提高植物抗逆性奠定基础。     

辣椒质膜水通道蛋白CaPIP1基因全长cDNA的分离及序列分析

通过对辣椒均一化cDNA文库的筛选分离获得了一个与烟草水通道蛋白NtAQP1高度同源的aquaporin基因全长cDNA,命名为CaPIP1。序列分析结果表明该cDNA包含有858 bp的完整开放阅读框,编码286个氨基酸,具有6个跨膜区,2个NPA模序以及植物质膜水通道蛋白高度保守的序列。氨基酸同源性及进化分析同样表明CaPIP1为辣椒水通道蛋白家族新成员。     

茶陵野生稻DREB类转录因子的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术获得了茶陵野生稻DREB类转录因子的cDNA全长.序列分析表明,此基因核苷酸序列全长为958bp,编码314个氨基酸,该序列与水稻DREB基因的同源性为98%.其编码的蛋白与小麦CRT/DREB4蛋白的同源性为93%,与大麦CBF2A蛋白和CBFIVc-14.1蛋白的同源性分别为93%和92%.推导蛋白第43～112位氨基酸为典型AP2结构,具有AP2/DREB类转录因子的基本结构特征,并构建了茶陵野生稻DREB基因的植物表达载体pWM101DREB.     

黄独微型块茎环阿屯醇合酶基因克隆与序列分析

获取黄独皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶(CAS)的基因全长cDNA序列，并进行序列分析。通过黄独微型块茎转录组数据库筛选得到CAS基因的核心片段，利用RT-PCR技术获得CAS基因保守片段，采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得CAS基因的3′及5′末端序列，并采用生物信息学方法进行序列分析。结果表明，黄独微型块茎CAS基因编码序列长2 280 bp,编码814 bp的氨基酸序列，相对分子量为86 665.17 u,等电点为6.21。CAS蛋白主要是由α螺旋(33.66%)、延伸链(21.62%)以及无规则卷曲(44.72%)构成。CAS蛋白为亲水性蛋白，无信号肽，三级结构为单体，含有CAS所必需的功能结构域，具有PLN03012多元结构域。CAS蛋白主要存在于质膜和内质网，可能为膜蛋白。黄独CAS蛋白与其他植物的CAS蛋白同源性较高，其中与菊叶薯蓣的CAS蛋白氨基酸相似性为96.05%。从黄独微型块茎中首次获得CAS基因cDNA全长序列，该基因具有CAS同源基因的典型特征。     

橡胶树水通道蛋白基因HbPIP1;2和HbPIP2;2的克隆及序列分析

根据GenBank中已经公布的不同植物水通道蛋白(AQPs)的保守氨基酸序列设计简并引物,结合RT-PCR和RACE技术,从橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了2个AQP基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果获得橡胶树2个AQPs基因的全长,分别命名为HbPIP1;2和HbPIP2;2。HbPIP1;2编码273个氨基酸,理论分子量为29.15kD,等电点为8.55;HbPIP2;2编码278个氨基酸,理论分子量为29.78kD,等电点为8.20。HbPIP1;2和HbPIP2;2均具有6个跨膜区和MIP家族信号序列SGXHXNPAVT,为疏水性蛋白;HbPIP1;2和HbPIP2;2与同科蓖麻水通道蛋白基因RcPIP1-3和RcPIP2-1的同源性分别为91%和89%,并具有相同功能域。因此,推测Hb-PIP1;2和HbPIP2;2都属于水通道蛋白基因家族的新成员。     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

梭梭过氧还蛋白基因（PrxQ）克隆与序列分析

采用RT-PCR、RACE方法从超旱生、耐盐植物梭梭中扩增出PrxQ基因cDNA序列,该序列全长966bp,包含654bp的开放阅读框,推测氨基酸序列全长为218个氨基酸残基,该蛋白分子量为24 106.0,等电点为9.78,含有2个保守的Cys残基。序列同源性分析结果显示,核苷酸序列与藜科几种盐生植物如碱蓬等的同源性为70.01%,与其他植物佛甲草等的同源性为55.30%。说明,PrxQ基因在藜科盐生植物中是一种较高保守的基因。     

蜡梅水通道蛋白基因（CpAQP）分子特征分析及植物表达载体的构建

在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过对文库cDNA克隆全长测序,得到了1个蜡梅水通道蛋白基因,命名为CpAQP(GeneBank登录号为：GU433105)。cDNA全长1154 bp,最大ORF 810 bp,编码269个氨基酸。聚类分析和同源性比对表明,该蛋白基因属于TIPs亚族类,具有高度保守的MIP家族结构域。该蛋白具有6个跨膜结构,N-末端和C-末端都在细胞内。利用NetPhos2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预测,该蛋白C端丝氨酸磷酸化,可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中,成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

樱桃CBF基因的克隆及序列分析

CBF(CRT/DRE-binding factor)基因是一种低温响应转录因子基因,CBF蛋白能够与很多低温相关基因的启动子结合,使其表达,从而增强植物抗冷能力。本研究利用已经公布的CBF序列的保守区设计特异引物,对樱桃砧木吉塞拉6号的cDNA进行扩增,成功获得CBF的全长序列。序列分析结果表明,其开放阅读框为723 bp,编码240个氨基酸,具有典型的AP2结构域及CBF特有的两段短肽序列。氨基酸序列同源性分析表明,该CBF与蔷薇科植物同源性较高,与其他科属植物同源性较差。     

珠眉海棠水通道蛋白MzPIP1;1基因的克隆与表达分析

通过对珠眉海棠盐胁迫微列阵分析,从盐胁迫cDNA文库中分离得到盐诱导的水通道蛋白基因MzPIP1;1 cDNA序列全长1 135bp,开放阅读框共870bp,5′-UTR和3′-UTR的长度分别是91和174bp。MzPIP1;1编码289个氨基酸,有6个跨膜结构和2个NPA(Asp-Pro-Ala)保守区。聚类分析表明:MzPIP1;1和其他4个物种PIP1类同源性在80%以上,属于质膜水通道蛋白PIP1类。拟南芥原生质体瞬时转化结果表明MzPIP1;1定位在质膜上。半定量RT-PCR表明MzPIP1;1基因受到盐和低温诱导。推断MzPIP1;1基因在盐胁迫下的表达调控与珠眉海棠耐盐能力密切相关。     

山核桃水通道蛋白CcPIP同源基因克隆与表达分析

利用RACE方法,在山核桃嫁接过程中扩增出山核桃水通道蛋白同源基因CcPIP。应用生物信息学软件进行分析,预测该序列编码294个氨基酸,具有6个跨膜区,有MIP家族信号序列和高等植物PIP高度保守序列。通过NCBI同源性比较分析表明,该基因与葡萄、菜豆等物种的水通道蛋白基因同源性达到99%。荧光定量RT-PCR分析表明,CcPIP基因在芽中的表达量最低,其次是雄花序,果实,幼叶和茎,而在根中表达量最高。在山核桃嫁接前后,CcPIP基因在接穗中表达趋势和在砧木中的表达一致。CcPIP基因的表达量在山核桃嫁接前砧木和接穗中都有强烈表达,但在嫁接后3 d急剧下降,分别在砧木和接穗中下降了5倍和2倍。在随后的11 d里,CcPIP基因的表达量在砧木和接穗中开始上升,至嫁接后14 d基因的转录水平比嫁接后3 d分别增加了7倍和4倍。该CcPIP基因参与山核桃嫁接成活的水分运输过程中起到基因表达调控的作用。     

绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。     

植物质膜内在水通道蛋白PIPs的分子生物学研究进展

水是植物细胞的重要组成成分,植物水通道蛋白是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道,作为植物水通道蛋白的一个亚类,质膜内在蛋白PIPs定位于原生质膜,为典型的高水分选择性通道蛋白。主要介绍了PIPs的结构特征、生物学功能及其调控机制。高等植物PIPs存在2个高度保守的区域:GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VFWF/YN。PIPs分为PIP1和PIP2亚类,PIP1比PIP2具较长的N－端和较短的C－端,并且具有各自的保守氨基酸。通过转基因和非洲爪蟾卵Xenopus oocytes母细胞异源表达研究表明PIPs不仅是水和二氧化碳、甘油等中性小分子选择性通道蛋白,同时还具有许多生理功能,是一类多功能蛋白。蛋白翻译后修饰、异聚化、pH值、二价阳离子等都能调控PIPs的运输功能。表1参51     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长包含完整的cDNA开放读码框732bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因,并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因的克隆、序列分析及原核表达#br#

【目的】克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。【方法】根据MdMYB10基因编码区设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得1个约700 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a（+）中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21（DE3）中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR 获得的cDNA 全长包含完整的cDNA开放读码框732 bp,编码244个氨基酸,命名为MsMYB10。MsMYB10分子量为28.56 kD,等电点为8.41,GenBank登录号为GQ500894。该蛋白具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有1个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知MdMYB10的氨基酸序列的同源性为98%。另外,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果转录因子MsMYB10基因, 并可在大肠杆菌中转化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

亚洲玉米螟GOBP2的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

 【目的】克隆、序列分析和原核表达亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）GOBP2（OfurGOBP2)的cDNA。【方法】以亚洲玉米螟触角为材料,采用RT-PCR结合RACE方法克隆OfurGOBP2的cDNA序列,并在pGEX-4T-2/BL21（DE3）系统中进行原核表达, 进一步利用制备的抗体检测OfurGOBP2蛋白。【结果】从亚洲玉米螟触角中获得了GOBP2的cDNA序列（GenBank登录号为DQ673101）,序列分析表明,OfurGOBP2开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸残基,氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。一致性分析显示,OfurGOBP2与其它鳞翅目昆虫GOBP2编码的氨基酸一致性较高,表明昆虫的GOBP2在分子进化过程中是保守的。进一步将OfurGOBP2与表达载体pGEX-4T-2连接,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为41 kD的可溶性融合蛋白。SDS-PAGE分析和Western印迹检测结果表明,OfurGOBP2能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。利用制备的多克隆抗体对亚洲玉米螟GOBP2进行Western-blot分析,证明其能够特异识别OfurGOBP2蛋白。【结论】成功克隆了编码并表达亚洲玉米螟气味结合蛋白GOBP2 的cDNA序列,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究亚洲玉米螟GOBP2的结构和功能。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的克隆及原核表达

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠杆菌表达系统可以成功地体外表达奥利亚罗非鱼GnRH,为进一步制备抗体了解其免疫调节作用奠定基础。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。