表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG^-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK^-／gI^-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoR V／StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRV。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRV,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报)

根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。     

伪狂犬病毒PK基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK/gI缺失疫苗株为亲本株,提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段。将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA。用限制性内切酶SacⅠ NdeⅠ缺失质粒P8-AA中PK基因的2 218 bp片段,在此缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-CI-VP1中含绿色荧光蛋白基因和VP1基因的完整表达盒,构建出可用于同源重组的转移载体P8-EGFP-VP1。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得On-derstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Western blot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下了基础。     

表达犬瘟热H基因重组伪狂犬病毒的构建及生物学特性研究

[目的]构建表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,并研究其生物学特性。[方法]通过RT-PCR方法获得Onderstepoort株H基因,插入pcDNA3.1（＋）建立好完整的真核细胞表达盒并将此表达盒亚克隆到转移载体p8AA上。在此基础上再将报告基因LacZ的表达盒插入转移载体,命名为p8AAZH。将p8AAZH与伪狂犬病毒（PRV）Bartha-K61株基因组共转染至BHK-21细胞中进行基因重组包装出毒,待细胞病变后收集病毒液。通过蓝色蚀斑筛选、PCR、电镜观察以及Westernblot,筛选纯化重组病毒并鉴定目的基因的表达。同时在BHK-21细胞上测定重组病毒的生长曲线。[结果]获得了表达H蛋白的重组伪狂犬病毒,重组病毒与亲本Bartha-K61株的生长曲线、病变特征相一致。[结论]成功构建了表达犬瘟热Onderstepoort株H蛋白的重组伪狂犬病毒,H基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,为犬瘟热活病毒载体疫苗的研制与开发打下基础。     

伪狂犬病毒重组gG抗原片段的原核表达及其间接酶联免疫吸附测定方法的建立

[目的]建立方便可行的伪狂犬病毒血清抗体的酶联免疫吸附测定方法,并可特异性鉴别伪狂犬病毒TK-/gG基因缺失疫苗免疫株和野毒株.[方法]利用原核表达系统表达伪狂犬病毒gG抗原片段,蛋白纯化后包被,优化反应条件,建立一种用于检测伪狂犬病毒gG抗体的间接酶联免疫吸附测定方法.[结果]通过不同血清样品的检测试验,该酶联免疫吸附测定方法可以鉴别伪狂犬病毒TK-/gG-基因缺失疫苗免疫猪和感染野毒的血清学阳性猪.[结论]成功建立了检测伪狂犬病毒gG抗体的酶联免疫吸附测定方法,并可特异鉴别伪狂犬病毒TK-/gG-基因缺失疫苗免疫株和野毒株,此方法敏感性强,特异性高,操作简便,适合于临床大量检测.     

猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR鉴别

为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。     

通用山羊痘病毒TK基因缺失转移载体的构建

用PCR方法克隆了山羊痘病毒疫苗株(GTPV-TY)的TK基因,根据TK基因结构,设计了2对引物分别扩增得到与TK基因部分相邻的长度约1kb的同源重组臂序列,分别插入到pGEM-Teasy载体,通过SmaⅠ位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGHpolyA信号以及LacZ基因,构建了通用山羊痘病毒TK基因缺失转移载体pdTK.此转移载体为改造GTPV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗奠定了基础.     

法氏囊B细胞λ轻链基因编码蛋白在大肠杆菌中的表达

为获得鸡λ轻链基因的表达蛋白,采用聚合酶链反应从鸡法氏囊B细胞cDNA文库中扩增出分泌表达蛋白的编码基因;用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。经PCR鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于原核表达载体PET43a的相应酶切位点。经过基因序列测定、BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实克隆载体正确插入载体PET43a。转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到表达;且能与His-Taq单抗相结合。     

禽网状内皮增生病毒囊膜基因gp90的克隆表达及ELISA方法的初步建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒( reticuloendotheliosis virus,REV) SNV株前基因组cDNA序列,经生物信息学分析,设计并合成引物,以四川分离株REV-SC1为模板,扩增囊膜基因gp90抗原性、亲水性较高的121～1 023 bp基因片段;将目的基因克隆至pMD-19T载体,进行测序和比对;将基因片段按正确的阅读框架定向克隆至pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21( DE3),以IPTG诱导表达,包涵体洗涤纯化,探讨以重组gp90蛋白为包被抗原初步建立检测REV的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法.结果表明:1)REV-SC1株gp90核苷酸序列与在GenBank上已发表序列的同源性最高为99%,于231位、870位发生了2个碱基突变;2)SDS-PAGE分析表明表达蛋白分子质量约为45 ku,与预期分子质量大小相符;免疫印迹(Western-blot)结果表明重组蛋白具有生物学活性;3)间接ELISA检测方法的最佳抗原包被质量浓度为1.5 mg.mL-1,一抗稀释度为1:320,临界值为0.126;特异性、敏感性试验结果良好.综上,本试验成功表达了REV gp90蛋白,并对其在ELISA检测方面的应用作了初步探讨.     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre／loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位．占、切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。     

用于筛选化学预防剂的报告载体的构建

构建以TK为基本启动子,其上游由抗氧化反应元件(ARE)调控的报告载体pARE-TK-GFP以期用于化学预防剂的筛选.应用重组PCR技术,分别经3次PCR获得重组TK启动子并克隆入pMD18-T栽体中,经酶切和测序鉴定正确后连入pEGFP中构建载体pTK-GFP.人工合成的ARE插入TK基本启动子上游,成功构建报告载体pARE-TK-GFP.脂质体转染HepG2细胞并在荧光显微镜下观察有绿色荧光.该栽体的成功构建可为各种天然或人工合成的化学预防剂的筛选奠定基础.     

可删除非目的基因表达载体的构建

[目的]通过构建能够删除选择标记基因的表达载体,消除由非目的基因带来的影响,更好地研究转入基因的单一功能。[方法]利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,对DsRed2-1载体进行改造,分别引入LoxP序列及多克隆位点序列,并引入TK基因进行负筛选,最终获得无目的基因的表达载体。[结果]诱导的载体片段在分子水平上发生了重组,载体转染细胞在细胞水平上也产生了特异性红色荧光。[结论]Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系切实可行,有着广泛的应用前景。     

提高重组质粒转化E．coli DH5α方法的研究

研究了质粒载体和外源DNA的浓度、酶切体系的酶切时间以及酶切产物的链接时间对转化效率的影响。结果表明,当pUC19质粒载体的浓度为25ng/μL,外源基因λDNA的浓度为100ng/μL,酶切时间3h,且连接时间为14h时,构建出的重组质粒转化大肠杆菌DH5α效率最高。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

HSV_1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。