小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白（Imp）基因的克隆和分子特性分析

 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp 1051/Imp 2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0 kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495 bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4％和95.1％。蛋白质结构分析结果表明：小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。     

枣疯植原体免疫优势膜蛋白基因imp-DZ的克隆与原核表达

[目的]为了解枣疯植原体免疫优势膜蛋白的特征,并进行初步表达.[方法]对北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室测得的枣疯植原体JWB-Dongzao免疫优势膜蛋白基因imp-DZ序列进行一致性、进化树和蛋白信号肽与跨膜区分析,分别设计引物扩增完整imp-DZ序列和去除跨膜区编码序列,克隆到蛋白表达载体pBM30上进行原核表达.[结果]imp-DZ基因序列大小为459 bp,编码152个氨基酸,除与枣疯植原体Jwb-nky中一个编码假定蛋白的基因一致性达到96％之外,与其他植原体imp基因核苷酸和氨基酸序列一致性均低60％.枣疯植原体JWB-Dongzao的imp-DZ与16SrV组其他成员imp基因聚在一个分支.携带Imp-DZ跨膜区的重组菌无法表达该蛋白,去掉跨膜区后蛋白得到大量表达.[结论]该研究成功表达了枣疯植原体的免疫优势膜蛋白Imp-DZ,证实了跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达,为下一步制备该蛋白抗血清和探索植原体与寄主植物互作机制提供依据.     

小麦蓝矮病植原体延伸因子(EF-Tu) tuf基因序列的同源性分析

 【目的】利用分子生物学方法分析小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因，从亚组水平上确定小麦蓝矮病植原体的分类地位。【方法】电镜观察自然发病的小麦蓝矮病病叶；用引物fTufu/rTufu对小麦蓝矮病植原体延伸因子tuf基因进行PCR扩增；核苷酸序列测定及分析。【结果】经电镜超微结构观察，在韧皮部观察到大量典型植原体。通过PCR扩增得到约850 bp的特异片段。感受态转化后，进行测序，结果表明小麦蓝矮病植原体tuf基因片段长842 bp，编码280个氨基酸。分析比较15种植原体延伸因子tuf基因的同源性，结果表明小麦蓝矮病植原体与三叶草绿变（KVF）亲缘关系最近，核苷酸同源性为99.9％，氨基酸同源性为100％。【结论】从亚组水平上确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位，为研究小麦蓝矮病植原体的来源及致病分子机理提供理论依据。     

小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白rpl22和rps3的生物信息学分析

【目的】将生物信息学方法应用于小麦蓝矮病植原体(WBD)的分类研究,确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位。【方法】应用植原体核糖体蛋白(rp)基因通用引物对rpF1/rpR1,对WBD进行PCR扩增并得到特异片段,对特异片段进行测定及同源性分析。【结果】序列测定结果表明,WBDrp基因片段长1 240 bp,包含部分rps19基因和全部的rpl22和rps3基因,且后2个基因为重叠基因,分别编码129和252个氨基酸,rpl22和rps3蛋白的等电点分别为12.605和11.755。【结论】WBD与16SrⅠ-C亚组中三叶草绿变病(Clover phyllody)的KVE、KVG、CPh株系亲缘关系最近,核苷酸同源性依次为99.7%,99.6%和99.0%,WBD与KVE株系的rpl22和rps3基因编码的氨基酸同源性分别为100%和98%,因此将小麦蓝矮病植原体划归到16SrⅠ-C亚组。     

麦洼牦牛Toll样受体1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】克隆并分析高原牦牛Toll样受体1基因(TLR1)的特点。【方法】提取麦洼牦牛脾脏RNA,反转录合成cDNA,以其为模板分段扩增后拼接获得麦洼牦牛TLR1基因编码区序列,采用相关分析软件对基因进行序列分析,并对其编码的蛋白质进行基本理化性质分析及预测。【结果】分段扩增获得了TLR1基因1 484bp的上游序列和823bp的下游序列,拼接后获得2 287bp的cDNA序列。TLR1基因系统进化树及同源性比对结果表明,TLR1基因极其保守,牦牛TLR1基因与黄牛、绵羊等哺乳动物遗传距离很近。预测TLR1基因含有1个2 184bp的开放阅读框,编码727个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为83.148 7ku;预测TLR1蛋白在第500~600位氨基酸区域含有1个疏水区域,结合跨膜区预测认为该疏水区域可能是TLR1蛋白的一个跨膜区,TLR1蛋白二级结构主要以α-螺旋及自由卷曲为主。【结论】TLR1基因在高原牦牛与平原哺乳动物之间存在较高的同源性,这可能与TLR1蛋白重要的生理功能相关。     

云南花生丛枝植原体secY基因序列分析及结构预测

 对采自云南元谋的花生丛枝植株总DNA进行secY基因的巢式PCR扩增,得到约1700bp的特异扩增片段,将该扩增产物克隆后进行序列测定,表明该片段长1709bp,该序列包括部分rpl15基因、全部secY基因序列以及部分的map基因,为植原体部分spc核糖体蛋白操纵子,其中secY基因编码的蛋白包括420个氨基酸,为含有10个明显跨膜区的整合性跨膜蛋白。通过同源性比对及构建的系统进化树,表明该株系与来源于台湾、海南的花生丛枝植原体亲缘关系最近,确定了该株系属于16SrII A亚组成员。该分类结果与基于16SrDNA及rp基因的分析结果一致。     

山羊血管紧张素转换酶2基因的克隆表达与生物信息学分析

[目的]血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸,编码804个氨基酸残基。同源性比对发现,山羊ACE2基因核苷酸序列同源性与绵羊ACE2最高,为99%,与斑马鱼最低,仅为60%。遗传进化分析也表明该ACE2基因与绵羊的遗传距离最近,与斑马鱼处在两个不同的分支上。蛋白结构及理化性质分析预测该山羊ACE2蛋白属于稳定型蛋白,蛋白信号肽序列位于第1氨基酸(aa)~18氨基酸(aa)之间,蛋白跨膜螺旋预测为Ⅰ型跨膜蛋白。成功构建山羊ACE2蛋白胞外部分(19~738 aa)表达载体,表达出的蛋白相对分子质量约为90×103,主要以包涵体的形式在BL21(DE3)中表达。[结论]本试验首次成功克隆了山羊ACE2基因编码区(基因序列号:KF921008.1),并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,同时在大肠杆菌中高效表达了其胞外区蛋白。     

小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

采用nested-PCR技术对小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因片段进行扩增,并对扩增片段进行了序列测定及分析。结果表明,nested-PCR扩增得到约1.2kb的特异片段,经核苷酸序列测定获得小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因序列(1136bp);小麦蓝矮病植原体(WBD)与16Sr组中的各亚组代表植原体亲缘关系均达到96%以上,其中与三叶草变叶病植原体(CPh株系)亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.7%,归为翠菊植原体(CandidatusPhytoplasmaasteris)16Sr-C亚组,该结果与以前报道的利用16SrDNA的分组结果一致,从亚组水平上进一步确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位。     

油桐ACPase基因克隆及生物信息学分析

【目的】克隆油桐酸性磷酸酶(ACPase)基因的全长序列,为进一步分析油桐ACPase的功能奠定基础。【方法】根据油桐转录组酸性磷酸酶蛋白全长序列设计引物,利用RT-PCR从油桐种子中克隆ACPase基因,对其cDNA序列、核苷酸序列的相似性、理化性质、疏水性、跨膜结构、二级结构及三级结构进行分析预测,同时进行多序列比对并构建系统树。【结果】克隆获得油桐ACPase基因,其开放阅读框为1152 bp,编码383个氨基酸残基,相对分子质量为40.94 kDa,理论pI为5.30,属可溶性不稳定蛋白。同源性和进化树的预测分析结果显示,油桐ACPase与毛果杨的ACPase蛋白同源性达84%。油桐ACPase存在磷酸酶基因家族的保守区域,ACPase编码蛋白的大部分氨基酸属于亲水性氨基酸。其蛋白二级结构主要由不规则卷曲、α-螺旋和β-折叠构成。ACPase蛋白包含1个跨膜螺旋区域,其相应氨基酸位置在136~156;包含1个疑似跨膜域,其相应氨基酸位置在255~275;每个跨膜结构域为由20个氨基酸残基组成的螺旋,同时跨膜蛋白的N端和C端位于细胞膜胞质的一侧。【结论】油桐ACPase基因的表达可能与其体内磷营养的分解利用等过程有关。     

桑树查尔酮合成酶基因（CHS）的生物信息学分析（英文）

[目的]探讨桑椹色素代谢调控的分子机理。[方法]本研究以桑科植物的EST数据库为基础,采用生物信息学实验技术,通过电子克隆方法获得了桑树查尔酮合成酶基因（CHS）。采用生物信息学在线软件,进一步对该基因编码蛋白的氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构等方面进行了预测和分析。[结果]经DNAstar软件拼接后得到的cDNA序列为1 365 bp,其开放阅读框序列为1 170 bp,编码389个氨基酸残基。CHS蛋白含有查尔酮合酶家族的特征多肽序列RLMMYQQGCFAGGTVLR,不含信号肽序列,属于非分泌型蛋白,定位于细胞质内,分子进化也较为保守。[结论]该研究结果为深入研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

山东桑萎缩植原体secY基因序列分析

对采自山东宁阳的表现萎缩症状的桑树植株总DNA进行secY基因PCR扩增,得到约1.4 kb的特异片段,将该片段克隆后进行序列测定,结果表明,该片段长1 361 bp,包含secY基因1 242 bp,编码414个氨基酸。通过构建系统进化树、同源性比对及利用9种限制性内切酶进行模拟RFLP分析,初步确定该分离物属于secYⅠ-B亚组,在亚组水平上进一步明确了桑萎缩植原体的分类地位。     

自然状态下温度对桑花叶萎缩病的影响

采用生物统计方法,对自然状态下桑花叶萎缩病的发生动态进行了分析。结果表明:桑花叶萎缩病对桑树的生长影响极显著,可持续造成损失;影响桑花叶萎缩病病症表现的主要气象因素是温度,不同温度对病原体的影响存在显著差异,温度与病原体生长动态之间的关系可以用Y=13.5652/[1+exp(8.8781-0.220829X)]进行模拟;病枝隐显症表现的温度临界值为28.8℃。     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

1材料与方法 1．1材料随机采集五指山猪品种耳组织样共30份,将其迅速放入液氮带回实验室,-70℃保存备用。 1．2试剂RT—PCRKit、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒,均购自天根生物工程有限公司;SalⅠ、BamHⅠ、pMD18-TVector试剂盒、Ecoli DH5α均购自TaKaRa公司。     

桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的影响

[目的]探讨桑茎的降血糖活性,为研究桑树的降血糖活性奠定理论基础。[方法]用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)法测定3种不同浓度的桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并用SPSS统计软件对测定结果进行显著性分析。[结果]10.326、0.653和103.264 mg/ml桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分别为1.03%、-2.40%和0,表明桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶的抑制率低,抑制作用不明显。利用SPSS软件进行的显著性分析结果显示,3种浓度的桑茎浸提液在400 nm处的最终吸光值不存在显著差异,说明不同浓度的桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶的抑制率不存在显著差异。[结论]桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用不显著。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园;宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存;植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司;氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司;外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂;RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司;其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

桑黄化型萎缩病的发生与防治

介绍了桑树黄化型萎缩病在绩溪县发生的状况,分析其发生原因,提出了防治措施,以为桑树黄化型萎缩病的防治提供参考。     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

白城地区桑树主要病虫害的综合防治

2005—2006年间调查白城地区桑树主要病虫害种类、发生规律及综合防治技术。研究发现北方干寒地区桑园内主要虫害为桑蓟马和叶螨,主要病害为桑萎缩病和桑赤锈病。"向海1号桑"可作为干寒地区的抗病、抗虫综合抗性最强桑树品种推广。加强桑园的抚育管理,可预防病虫害的发生或降低受害程度。及时掌握害虫及天敌种群数量的变化趋势,是行之有效的预测预报方法。应用40%丙溴磷乳油对桑园蓟马和叶螨可以同时防治,防治效果达到98%以上。应用多抗霉素是防治桑赤锈病的首选药剂,可配合使用代森锰锌。乙蒜素防治桑萎缩病效果最好。     

几种常见桑树病害的识别与防治

介绍4种常见桑树病害桑疫病、桑褐斑病、桑炭疽病、桑黄化型萎缩病的危害症状、发生规律和防治方法,为生产上防治相关病害提供参考。防治桑树病害应选栽抗病品种,加强栽培管理,科学合理地选用化学药剂。     

大麦黄矮病毒运动蛋白形成同型二聚体的功能研究

[目的]利用荧光双分子互补技术研究大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-PAV,MP）形成二聚体的可能性,并研究MP同型二聚体与病毒运动之间的关系。[方法]将双分子荧光互补载体中包含多克隆位点、35S启动子及终止子的DNA片段构建到拷贝数较高的植物表达载体pCAMBIA1300上,然后以BYDV-PAV的全长cDNA为模板,根据GenBank中登记的BYDV-MP的基因序列设计引物,通过PCR扩增得到目的基因片段BYDV-MP,克隆到经过改造的双分子荧光互补载体pCAMBIA1300-NE、pCAMBIA1300-CE上,得到了重组的双分子荧光互补载体。电击转化农杆菌,利用农杆菌渗透注射技术注射到烟草叶片,荧光显微镜下观察植物体内的蛋白互作现象。[结果]农杆菌渗透注射后,2～5d观察双分子荧光互作现象,MP蛋白互作组及正对照组叶片产生黄色荧光,负对照组未有荧光现象。[结论]BYDV-MP在植物体内形成同源二聚体,该研究结果为进一步深入开展BYDV运动过程和机理等研究提供了理论依据。