抗哈维氏弧菌脂多糖单克隆抗体的制备及其鉴定

以哈维氏弧菌GYC1108-1细菌颗粒性抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,5次免疫后取其脾细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合.用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对杂交瘤进行筛选,阳性克隆经3次亚克隆后,获得一株针对GYC1108-1脂多糖(LPS)的特异性单克隆抗体,命名为2 F 9.该株单抗细胞培养上清ELISA效价为1:1 600,腹水效价为6.4×104,交叉反应结果表明2 F 9除了与测试的多株哈维氏弧菌发生免疫识别外,还与溶藻弧菌、麦氏弧菌和副溶血弧菌代表株发生免疫交叉反应,但不与拟态弧菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌代表株等发生交叉反应.用温和高碘酸氧化法对LPS处理后,GYC1108-1的LPS与2 F 9的反应部分减弱,免疫印迹结果表明2 F 9识别LPS的类脂A抗原.用抑制ELISA法半定量检测GYC1108-1培养上清的LPS,测得培养48 h LPS释放量不超过39μg/mL,大大低于使鱼类致死所需的LPS的剂量.     

哈维氏弧菌的主要致病因子及其特性分析

从大黄鱼致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)GYC1108-1株提取外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和胞外产物(ECP),并进行毒性实验,以研究哈维氏弧菌的主要致病因子及其特征.结果表明:OMP、LPS致病性较弱,而ECP可导致鱼死亡,初步得出哈维氏弧菌GYC1108-1株的主要致病因子为胞外产物,其对鱼的半数致死量(LD50)为3.5 μg·g-1;该蛋白酶与底物偶氮酪蛋白(azocasein)作用的最适pH为8.0,最适温度28℃,对热敏感,分子质量为55 ku;该酶活性被碘乙酸抑制,也被SDS和HgCl2完全抑制,PMSF和ZnCl2能部分抑制该蛋白酶活性,而CuCl2、CaCl2、MgCl2对该酶活性影响不大,2-巯基乙醇、DTT、L-半胱氨酸、EDTA和EGTA对该酶活性有促进作用,表明其为半胱氨酸蛋白酶;研究发现ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和脂肪酶活性,无脲酶活性;免疫印迹结果发现GYC1108-1的ECP能与大黄鱼抗GYC1108-1血清发生免疫发应,分子质量为55 ku的半胱氨酸蛋白酶是具有免疫原性的物质.     

抗红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原哈维弧菌单克隆抗体的制备及特性分析

以红鳍东方鲀皮肤溃烂病病原——哈维弧菌2SYX002为抗原,通过杂交瘤技术制备了抗哈维弧菌的单抗1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、2E7、4A7、5B2、4E12、1G3、7D7、8E10、4D12、2B9、7D6、6E6、1G2、6G6和2C1。特性分析结果表明:有8株单克隆抗体(1B6、1D6、1A4、5B4、6C6、7D6、6E6、6G6)特异性较差,与试验中所有菌株均发生反应;有6株(4A7、4E12、7D7、8E10、4D12、2B9)只与免疫菌株哈维弧菌2SYX002反应,与其他菌株均不发生反应。5株单抗(2E7、5B2、1G2、2C1、1G3)与部分参考菌株有不同程度交叉反应;通过进一步特性分析,从中筛选出单克隆抗体2C1,其抗原包被浓度为5×107 cells/m L时,与试验中所有哈维弧菌分离株反应均为阳性,除溶藻弧菌外不与其他参考菌株发生交叉反应,效价为1:256。本研究扩充了哈维弧菌单克隆抗体库,为哈维弧菌单克隆抗体的进一步应用提供参考数据。     

同腹异育银鲫对鱼类3种致病弧菌粗脂多糖的免疫应答

用从鳗弧菌（Vibrio anguillarun)，哈维氏弧菌（Vibrio harveyi)和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)等3种弧菌中提取的菌体粗脂多糖（LPS）作为免疫原，分别经胸鳍基部接种同腹异育银鲫（Carassius auratus gibelio)后，通过测定受免鱼的凝集抗体效价，明和血液中吞噬细胞的吞噬活性和杀菌活性，检测3种弧菌的粗LPS对异有银鲫免疫应答的试验结果。结果表明，3种弧菌的粗LPS对异育银鲫均具有较强的免疫原性，受免鱼的血清中出现对3种弧菌的福尔马林灭活菌体（FKC）的交叉凝集抗体；与对照鱼相比，受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性和杀菌活性明显上升，证明在3种弧菌的粗LPS上存在共同保护性抗原，而且这些共同保护性抗原对异育银鲫具有较强的免疫原性。     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU的克隆、表达与免疫原性研究

根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpU的基因序列设计1对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,自哈维氏弧菌致病菌株基因组中扩增获得一段约1 000 bp的序列,构建重组载体pMD18-T-OmpU;测序结果表明,该基因与已发表的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU序列存在98%以上的相似性,该序列在GenBank上的登录号为FJ919231.构建表达质粒pET-30a(+)-OmpU后转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现高效表达,SDS-PAGE显示重组蛋白分子质量约为41 ku,与预期基本相符.重组蛋白以包涵体形式表达.以脲素法得到初步纯化的重组蛋白,以50 μg/mL的剂量注射免疫大黄鱼幼鱼,经间接ELISA法检测了4~8周后特异性抗体的效价,同时检测了注射后4周的免疫保护率.结果表明,4~8周内特异性抗体效价持续升高,达到log2 8.0以上,4周时的相对免疫保护率为85%.试验结果显示了重组哈维氏弧菌外膜蛋白OmpU具有良好的免疫原性,可作为亚单位疫苗的开发对象.     

鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原,应用杂交瘤技术,制备了鳗弧菌单克隆抗体3株,分别命名为1H9、1C12、6F8,细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b,其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体,效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫,抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜,分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定,结果表明:试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌,7种水产常见病原菌没有交叉反应,与鳗弧菌特异性反应,检测灵敏度为6.3×104cfu·mL~(-1),检测所需时间低于10min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。     

哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用

从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶（trxR）基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。构建表达质粒pET-28a（＋）/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

抗腺病毒五邻体单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

为获得稳定性好、特异性强、效价高的抗腺病毒五邻体单克隆抗体,用腺病毒五邻体基因工程表达抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,以腺病毒五邻体为筛选抗原对融合后的杂交瘤细胞间接ELISA进行筛选.结果表明:试验获得5株杂交瘤细胞,标记为3C4、4C4、4D7、4F2和4H3,4D7免疫球蛋白亚类为IgG2a,其余4株为IgG1;对5株细胞连续3个月体外传代试验和小鼠腹水连续传代试验,5株细胞都能持续稳定分泌单克隆抗体,对细胞上清和腹水采用间接ELISA进行效价测定,细胞上清效价稳定维持在2 000左右,腹水效价稳定维持在200 000以上,且与引起腹泻的鼠伤寒沙门氏菌和轮状病毒无交叉反应;对其中可以配对的2株单抗4D7、4F2建立双抗夹心ELISA,可以应用于临床检测腺病毒.     

盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其特性

以戊二醛法将盐酸克伦特罗 (Clenbuterol,CL)连接到牛血清白蛋白 (BSA)上制备抗原(BSA -CL) ,并以BSA -CL免疫Balb/c小鼠 ,应用杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与NS0细胞融合 ,建立分泌CL单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过对杂交瘤细胞培养上清的检测、鉴定 ,筛选出 1 7株高亲和力的杂交瘤细胞株 ,其中C - 4C9、C - 2D6、C - 4G1和C - 2H6的培养上清ELISA效价为 1∶5 1 2 ,1∶640 ,1∶81 0和 1∶2 5 6;腹水ELISA效价为 5× 1 0 - 6,1 .7× 1 0 - 5,2×1 0 - 6和 3.3× 1 0 - 5。 4株单抗与 β -肾上腺素激动剂沙丁胺醇的交叉反应性为 0 .79% ,与肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素及畜禽常用抗生素无交叉反应性。可以作为制备CL快速检测的特异性单克隆抗体应用