马氏珠母贝TLRP基因克隆及其功能研究

【目的】明确马氏珠母贝TLRP基因（PmTLRP）的组织表达特征及哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）刺激、植核及脂多糖（LPS）刺激后的时序表达特点,为进一步研究TLRs在马氏珠母贝中的免疫机制打下基础。【方法】采用RACE克隆PmTLRP基因cDNA序列,通过ProtParam、 ProtScale、 SignalP 4.0、 TMHMM v.2.0、 SMART、 SoftBerry Psite和SOPMA等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测PmTLRP基因在马氏珠母贝各组织中及经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后的表达情况。【结果】 PmTLRP基因cDNA序列全长2214 bp,包含33 bp的5'非编码区 （5'-UTR）、135 bp的3'非编码区（3'-UTR）及2043 bp的开放阅读框（ORF）,共编码681个氨基酸残基;其编码蛋白含有信号肽、富含亮氨酸重复序列 （LRRs）、跨膜结构域和TIR结构域,符合TLRs家族所具有的特征; PmTLRP氨基酸序列与其他物种的TLRs氨基酸序列存在一定相似性,其中与美洲牡蛎TLP氨基酸序列的相似度较高。PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达,以在肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量 （P<0.05）。在哈维氏弧菌刺激下, PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量于注射刺激后12 h开始上调,至注射刺激后16 h达最大值,约是注射刺激前 （0 h）的19.0倍。经植核刺激后, PmTLRP基因相对表达量在植核后5~20 d呈逐渐上升趋势,于植核后30 d达最大值,约是植核前 （0 h）的6.4倍。在LPS刺激下, PmTLRP基因在血淋巴中的相对表达量先上升后下降,至注射刺激后3 h达最大值,约是对照组的5.0倍; PmTLRP基因在肝胰腺中的相对表达量呈升高→降低→升高→降低→升高的波动变化趋势,至注射刺激后24 h相对表达量上调到最大值,约是对照组的6.0倍。【结论】 PmTLRP基因在马氏珠母贝外套膜、血淋巴、肝胰腺、鳃、性腺和闭壳肌中均有表达,但表达水平存在差异,经哈维氏弧菌、植核及LPS刺激后呈明显上调表达趋势,说明TLRP在马氏珠母贝的免疫防御反应中扮演重要角色。     

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框（ORF）1026 bp,5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp,3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点（pI）为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P.fucata martensii）CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas,XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians,ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata,AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）,其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。     

光裸星虫CyclinB基因克隆及其在卵母细胞中的表达分析

【目的】探究细胞周期蛋白B （CyclinB）基因在光裸星虫（Sipunculus nudus）卵母细胞发育成熟过程中的作用,为揭示光裸星虫卵母细胞发育的分子机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆光裸星虫CyclinB（Sn-CyclinB）基因cDNA序列,通过ProtParam、DNAMAN 9.0、COBALT、SOPMA、Phyer2、Pfam及BLAST等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测分析Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期的表达情况。【结果】Sn-CyclinB基因cDNA序列全长2468 bp,包括141 bp的5'端非翻码区（5'-UTR）、1097 bp的3'端非翻码区（3'-UTR）及1230 bp的开放阅读框（ORF）,编码409个氨基酸残基,在3'-UTR中存在3个胞质多聚腺苷酸化元件（CPE）、1个翻译调控元件（TCE）和1个K-box翻译调控元件。Sn-CyclinB蛋白分子量为46.304 kD,理论等电点（pI）为8.68,具有CyclinB特征序列（FLRRxSK）和Cyclin降解框（RxALGxIxN）,属于亲水性蛋白,含有周期蛋白框（Cyclin box）;其二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占56.72%、3.91%、0.73%和38.63%;CyclinB蛋白C端的保守性较N端高;与其他物种相比,光裸星虫Cyclin降解框（RALGTISN）的位置前移了13个氨基酸;光裸星虫与小头虫和欧洲帽贝的CyclinB蛋白三级结构高度相似。基于CyclinB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树分为无脊椎动物和脊椎动物两大支,其中光裸星虫与小头虫及水蛭等无脊椎动物聚为一支。Sn-CyclinB基因在光裸星虫卵母细胞不同发育时期均有表达,且整体上呈双峰型变化趋势,其相对表达量的峰值分别出现在卵黄旺盛合成后期（O3）和肾管发育时期（O5）。【结论】Sn-CyclinB蛋白具有CyclinB特征序列,其3'-UTR含有多种与翻译调控相关的调控元件,参与光裸星虫卵母细胞减数分裂G1/S期和G2/M期的转换,对促进卵母细胞减数分裂有序进行起重要作用。     

马氏珠母贝细胞内视黄酸结合蛋白表达及其与类胡萝卜素的相关性分析

[目的]明确细胞内视黄酸结合蛋白(CRABP)对马氏珠母贝吸收代谢类胡萝卜素的影响,为培育富含类胡萝卜素的马氏珠母贝养殖新品系打下基础.[方法]采用RACE克隆马氏珠母贝CRABP基因(PmCRABP)cDNA全长序列,并以实时荧光定量PCR检测分析PmCRABP基因在各组织中的表达特征及其在黄白闭壳肌中的表达量.[结果]PmCRABP基因cDNA全长1778 bp,开放阅读框(ORF)长366 bp,编码121个氨基酸,其5'非翻译区(5'UTR)长125 bp,3'UTR长1287 bp.PmCRABP的分子量13.51 kD,理论等电点(pI)5.68,脂溶性系数62.81,不稳定指数35.38,总平均亲水性-0.517,其第5~120个氨基酸为Lipocalin家族的结构域.PmCRABP氨基酸序列与新对虾(Metapenaeus ensis)CRABP氨基酸序列的相似度最高,同属于CRABP蛋白,且二者的空间结构极其相似.PmCRABP基因在马氏珠母贝肝胰腺中的表达量最高,其后依次是外套膜、鳃和闭壳肌,各组织的表达量差异显著(P<0.05,下同).黄白闭壳肌个体的类胡萝卜素含量与PmCRABP基因相对表达量存在显著差异,且二者间呈明显的正相关.[结论]PmCRABP参与了马氏珠母贝的类胡萝卜素代谢.     

黄鳝nanos3基因克隆鉴定及其组织表达分析

【目的】明确nanos3基因在黄鳝卵巢发育和维持过程中的重要作用,为黄鳝PGCs可视化分子标记、生殖细胞移植及性腺发育分化机制研究打下基础。【方法】通过RACE克隆黄鳝nanos3基因cDNA序列,运用ProtParam、 SOMPA、 SWISS-MODEL、 SignalP、 TMHMM及NetPhos等在线软件进行nanos3蛋白生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR检测nanos3基因在黄鳝不同组织中的表达情况,并以冰冻切片荧光原位杂交进行性腺组织定位。【结果】黄鳝nanos3基因cDNA序列全长1289 bp,包括147 bp的5'非编码区 （5'-UTR）、 531 bp的开放阅读框 （ORF）及611 bp的3'非编码区（3'-UTR）,共编码176个氨基酸残基。黄鳝nanos3蛋白分子量为19.61 kD,理论等电点（pI）为9.07,为碱性蛋白;在黄鳝nanos3氨基酸序列第108~162位处存在2个锌指基序 “CCHC”结构域,无信号肽和跨膜结构域;蛋白二级结构以无规则卷曲的占比最高 （64.20%）,其次是α-螺旋 （占24.43%）,延伸链、 β-转角的占比分别为6.82%和4.55%。黄鳝与大刺鳅、射水鱼、斑马鱼等鱼类的nanos3氨基酸序列相似性分别为67.5%、 57.2%和50.3%,与中国林蛙、粗皮蛙等两栖类动物的相似性分别为39.3%和30.3%,与人类、小鼠等哺乳类动物的相似性分别为33.3%和30.9%。nanos3基因在黄鳝肌肉中不表达,在精巢、肾脏、脾脏、脑、肝脏、肠道、心脏和血液中的相对表达量较低,在卵巢中的相对表达量最高,极显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.01）,呈明显的组织特异性表达模式;冰冻切片荧光原位杂交分析结果显示,黄鳝nanos3基因仅在生殖细胞中表达,支持细胞中未见表达。【结论】黄鳝nanos3基因进化相对保守,主要在卵巢的生殖细胞中表达,且以细胞质中的表达为主,与核遗传信息的传递相关,是黄鳝性腺发育及分化相关的功能基因。     

文蛤CDK7基因克隆及其在不同品系生长发育中的表达分析

【目的】掌握文蛤（Meretrix meretrix）细胞周期蛋白依赖性激酶7（CDK7）基因（MmCDK7）的时空表达及在不同品系生长发育中的表达规律,从分子水平探究红壳色文蛤新品系的生长优势,为筛选文蛤生长相关基因及揭示其生长发育机制提供理论依据。【方法】利用RACE克隆MmCDK7基因cDNA序列,通过BLAST、ScanProsite、NetPhos3.0 server及ExPASy等在线软件进行生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR检测MmCDK7基因在文蛤不同组织和不同发育时期的表达情况,并比较同一养殖条件下红壳色文蛤（简称红文蛤）和黄壳色文蛤（简称黄文蛤）的壳长、壳长相对增长率及MmCDK7基因表达差异。【结果】MmCDK7基因cDNA序列全长1296bp,其中,5'端非编码区（5'-UTR）为83bp,3'端非编码区（3'-UTR）为196bp,开放阅读框（ORF）为1017bp,共编码338个氨基酸残基。MmCDK7蛋白分子量约38.32 D,理论等电点（pI）为8.78,包含丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域（S_TKc）、酪氨酸激酶催化结构域（TyrKc）及与细胞周期蛋白结合有关的激酶结构域NRTALRE;而S_TKc结构域中有包含蛋白激酶ATP结合位点区域、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活化位点区域及T-loop环。MmCDK7氨基酸序列与虾夷扇贝CDK7氨基酸序列高度同源,其相似性为75.00%;基于CDK7氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,文蛤与中国真蛸、长牡蛎、厚壳贻贝及虾夷扇贝等软体动物先聚为一支。MmCDK7基因在性腺、水管、外套膜和肝胰腺等组织中均有表达,以性腺中的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05,下同）;MmCDK7基因在2种文蛤的8个发育时期均有表达,均以多细胞时期的相对表达量最高。在同一养殖条件下,除9月18日外,其他采样时间点均表现为红文蛤的壳长显著大于黄文蛤,红文蛤相对于黄文蛤的壳长增长率在2.79%~32.37%;除11月15日和11月30日外,其他采样时间点均表现为红文蛤的MmCDK7基因相对表达量显著高于黄文蛤的相对表达量。【结论】MmCDK7基因属于CDK家族成员,在细胞分裂旺盛的性腺及多细胞时期的相对表达量最高,且在生长速度较快红文蛤中的相对表达量多数情况下显著高于黄文蛤,故推测MmCDK7基因参与调控文蛤的早期生长发育过程。     

翅碱蓬脱水素基因克隆及表达载体构建

【目的】克隆翅碱蓬脱水素蛋白基因并构建其植物表达载体,为其耐盐性研究奠定基础。【方法】提取翅碱蓬总RNA,通过同源克隆和RACE方法分离获得翅碱蓬脱水素蛋白基因,并构建该基因的植物表达载体pBI121-DHN。【结果】克隆获得翅碱蓬脱水素蛋白基因的全长cDNA为847 bp（GenBank序列编号：KC013239）,命名为SsDHN。序列分析结果表明,SsDHN全长cDNA中5'-UTR 为61 bp, ORF为678 bp,3'-UTR为108 bp且包含29 bp的poly（A）尾巴,其起始密码子ATG位于62 bp处,终止密码子TAA位于737 bp处,编码225个氨基酸。氨基酸比对结果表明,该基因推导的氨基酸与已知其他植物DHN基因序列有35%~48%的相似性。聚类分析结果显示,翅碱蓬（SsDHN）与拟南芥和荠菜DHN亲缘关系较近,与咖啡、杜鹃花的亲缘关系较远。【结论】成功克隆了翅碱蓬脱水素基因,并构建了其表达载体,可用于翅碱蓬抗盐的遗传改良。     

红鳍笛鲷视杆蛋白和长波敏感视蛋白的基因克隆及表达规律分析

【目的】克隆红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)视杆蛋白(RH1)基因和长波敏感视蛋白(LWS)基因,并分析其在早期发育不同阶段和成鱼不同组织的表达规律,为探究笛鲷属鱼类适应从表层浮游逐步转为下层底栖光环境生活的过程提供理论基础。【方法】利用RACE克隆红鳍笛鲷RH1基因和LWS基因cDNA全长,利用生物信息学软件对2个基因序列及编码的氨基酸序列进行分析,并利用实时荧光定量PCR检测其在红鳍笛鲷6个胚胎发育时期(原肠下包1/2期、胚孔封闭期、视囊期、晶体出现期、心脏跳动期、孵化出膜期)和5个仔鱼发育时期(1、3、10、15和20 d),以及成鱼不同组织(脑脏、心脏、肝脏、肌肉、黑色皮肤、红色皮肤、胃和视网膜)的表达规律。【结果】红鳍笛鲷RH1基因和LWS基因cDNA全长分别为1723 bp和1302 bp,其中RH1基因具有465 bp的3'-UTR和196 bp的5'-UTR,开放阅读框(ORF)长度为1062 bp,编码353个氨基酸残基;LWS基因具有213 bp的3'-UTR和15 bp的5'-UTR,ORF长度为1074 bp,编码357个氨基酸残基。系统发育分析结果显示,2个视蛋白基因均先与鲈形目等鱼类聚为一支,再与鳉形目、鲽形目和鲤形目等聚为一支,最后再与陆生脊椎动物聚为一支。实时荧光定量PCR检测结果显示,RH1基因在孵化出膜后15和20 d的相对表达量显著高于其他时期(P<0.05,下同),LWS基因在孵化出膜后20 d的相对表达量显著高于其他时期;2个视蛋白基因在成鱼不同组织的表达模式相似,在视网膜上的相对表达量均显著高于其他组织。【结论】红鳍笛鲷RH1和LWS基因的表达具有组织特异性,且在早期发育阶段的表达水平与红鳍笛鲷的生活习性变化相关,表明红鳍笛鲷RH1和LWS基因表达与其生活光环境的变化密切呼应,在早期发育变态阶段的光线调节,以及适应黑暗环境等方面发挥重要作用。     

草菇多酚氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】解析草菇多酚氧化酶基因家族序列信息,明确其特征和表达模式。【方法】通过转录组测序找出含有酪氨酸酶结构域的基因,并根据搜索得到的序列设计引物,以不同发育时期的草菇 v26 菌株,以及草菇蛋形期外菌膜、菌盖、菌柄等不同组织为材料提取 RNA,经反转录为 cDNA,扩增获得草菇多酚氧化酶基因序列。采用在线生物信息学网站预测草菇多酚氧化酶的理化性质。采用 RT-PCR 的方法,检测草菇不同发育时期和不同组织部位多酚氧化酶的表达模式。【结果】获得 4 个草菇多酚氧化酶基因家族的 CDS 序列,依次命名为 VvPPO1、VvPPO2、VvPPO3、VvPPO4,其中 VvPPO1 CDS 全长 1 596 bp、编码 531 个氨基酸,VvPPO2 CDS 全长 2 685 bp、编码 894 个氨基酸,VvPPO3 CDS 全长 1 593 bp、编码 530 个氨基酸,VvPPO4 CDS 全长2 067 bp、编码 688 个氨基酸。生物信息学分析表明,4 个基因编码的蛋白均含有 2 个铜离子结合区,为亲水性蛋白;RT-PCR 结果显示,4 个基因在草菇发育的菌丝期、原基期、蛋形期、成熟期均有表达,VvPPO1、VvPPO3 和VvPPO4 的表达量在子实体时期高于菌丝期,在蛋形期 VvPPO1 和 VvPPO4 在外菌膜的表达量比在菌柄和菌盖中的表达量高。【结论】在草菇中搜索得到 4 个多酚氧化酶基因,均含有 2 个铜离子结合区,4 个基因在各个发育时期均有表达。     

白斑狗鱼StAR基因克隆及其表达分析

【目的】克隆白斑狗鱼（Esox lucius）类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）基因（ElStAR）并分析其组织表达差异,为开展StAR基因生物学功能研究及揭示白斑狗鱼性腺发育机制提供基础资料。【方法】根据GenBank已公布的白斑狗鱼基因组测序结果（NC_047581.1）设计特异性引物,采用RT-PCR克隆ElStAR基因cDNA序列,通过ClustalX、ExPASy、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和SignalP 5.0等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR进行ElStAR基因组织表达定量分析。【结果】ElStAR基因cDNA序列长度1485 bp,其开放阅读框（ORF）为864 bp,共编码287个氨基酸残基;ElStAR氨基酸序列与北极红点鲑StAR氨基酸序列的相似性最高（93.33%）,与海鳟、条纹鲈鱼、金头鲷、大菱鲆、斑马鱼、半滑舌鳎的相似性均高于75.00%,而与小家鼠的相似性最低（59.15%）;基于StAR氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示白斑狗鱼与北极红点鲑和海鳟等鲑科鱼类处于同一分支。ElStAR蛋白相对分子量为32.23 kD,理论等电点（pI）为8.98,为不稳定的亲水性蛋白;具有START结构域,无信号肽及跨膜结构,符合线粒体靶向肽的基本特征。ElStAR蛋白二级结构由α-螺旋（占40.77%）、无规则卷曲（占35.89%）、延伸链（占18.12%）和β-折叠（占5.23%）组成,其三级结构是由α-螺旋配合多个β-折叠卷曲盘旋而成。ElStAR基因在白斑狗鱼精巢、卵巢、头肾、肝脏、肌肉及脑组织中均有不同程度的表达,且在精巢中的相对表达量极显著高于在卵巢中的相对表达量（P<0.01）,呈明显的性别二态性表达模式。【结论】ElStAR基因编码蛋白结构和功能十分保守,具有典型的START结构域,对胆固醇的运输和调节起重要作用。ElStAR基因在白斑狗鱼精巢及卵巢中的表达存在极显著差异,可能在维持白斑狗鱼精巢的发育形成中发挥重要作用。     

淡水养殖凡纳滨对虾生长相关基因HDAC1克隆及其表达分析

【目的】分析组蛋白去乙酰基酶1基因（HDAC1）在不同淡水生长特性家系凡纳滨对虾中的表达情况,明确HDAC1基因在对虾淡水养殖过程中的功能作用,为揭示凡纳滨对虾生长调控的分子机制提供参考依据。【方法】通过RACE克隆凡纳滨对虾HADC1基因cDNA序列,利用DNAMAN、ProtParam、ProtScale、PSOR...     

卵形鲳JunB基因克隆及其胚胎组织表达分析

【目的】明确卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）JunB基因（ToJunB）在胚胎发育过程中的表达规律,为揭示JunB基因在鱼类胚胎发育过程中的作用机制打下基础。【方法】采用RT-PCR扩增ToJunB基因编码区（CDS）序列,通过ProtParam、NetSurfP 2.0、TMHMM、SignalP、PSORT及NetNGlyc 1.0等在线软件进行生物信息学分析,并采用荧光定量PCR检测ToJunB基因在卵形鲳鲹17个胚胎发育时期（受精卵、2-细胞期、8-细胞期、16-细胞期、32-细胞期、64-细胞期、多细胞期、高囊胚期、原肠早期、原肠中期、原肠末期、胚胎形成期、眼囊期、耳囊期、心脏跳动期、晶体出现期和初孵仔期）的表达情况。【结果】克隆获得的ToJunB基因（1777 bp）包含344 bp的5'端非编码区（5'-UTR）、954 bp的开放阅读框（ORF）及479 bp的3'端非编码区（3'-UTR）,共编码318个氨基酸残基;其编码蛋白分子量为35.03 kD,理论等电点（pI）为8.26,呈碱性;总平均疏水指数（GRAVY）为-0.567,为亲水性蛋白。ToJunB蛋白无跨膜结构和信号肽,主要定位于细胞核,属于非分泌型蛋白,在第39、129和168位氨基酸处各存在1个潜在的糖基化位点;其二级结构中α-螺旋占35.67%、延伸链占14.33%、无规则卷曲占50.00%。基于JunB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,卵形鲳鲹与黄尾鰤的遗传距离最近,均隶属于鲈形目鲹科。ToJunB基因在胚胎发育前期（受精卵至原肠早期）的相对表达量较高,至原肠中期达最高值,在胚胎发育后期（原肠末期至初孵仔期）的相对表达量均较低,且ToJunB基因在受精卵至原肠中期共10个发育时期的相对表达量极显著高于胚胎发育后期的7个时期（P<0.01）。【结论】ToJunB基因在卵形鲳鲹胚胎受精卵至原肠早期的相对表达量较高,于原肠中期达最高值后迅速降低,原肠末期至初孵仔期的相对表达量均较低,说明JunB基因在卵形鲳鲹胚胎发育的细胞分裂和增殖过程中发挥重要作用。     

桔小实蝇P450基因CYP6A41的克隆与表达分析

【目的】克隆桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)P450基因,研究其在不同组织及发育时期的表达情况,探索其可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆桔小实蝇P450基因CYP6A41;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究CYP6A41mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。采用Homology程序模拟构建CYP6A41蛋白的三维结构,应用CDOCK程序将之与甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲基丁香酚3种气味分子进行模拟对接分析。【结果】克隆获得了桔小实蝇P450基因,并命名为CYP6A41。CYP6A41阅读框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,该蛋白序列与桔小实蝇的另外一种P450蛋白CYP4D46序列的一致性最高,达99.2%。荧光定量PCR分析表明,CYP6A41在桔小实蝇不同发育时期都有表达,并且在化蛹第1天表达量达到最高峰;CYP6A41在各组织中也都有表达,但以触角中的表达量最高;雄虫生殖节中的表达量约是雌虫的6.8倍;对接结果表明,CYP6A41蛋白与3种小分子化合物均能形成稳定的复合物。【结论】CYP6A41在桔小实蝇雌雄生殖节中的差异表达,暗示该蛋白在雄虫生殖生理过程中发挥作用;CYP6A41在化蛹第1天及触角中的高表达量暗示CYP6A41不仅参与了蛹早期的发育过程,且可能参与了嗅觉气味分子的降解过程。     

黑鲷催乳素基因PRL1和PRL2在急性盐胁迫环境下的表达分析

【目的】明确催乳素基因（PRL1和PRL2）在黑鲷不同组织及不同盐度胁迫下的表达模式,为黑鲷养殖过程中最适盐度范围的确定提供参考依据。【方法】通过RT-PCR扩增黑鲷PRL1和PRL2基因,以ExPASy、NetNGlyc及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测PRL1和PRL2基因在黑鲷不同组织及不同盐度胁迫下的表达情况。【结果】黑鲷PRL1基因开放阅读框（ORF）全长639bp,共编码212个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为23.32kD,理论等电点（pI）为6.70;黑鲷PRL2基因ORF全长750bp,共编码249个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为28.31kD,pI为8.37。黑鲷PRL1和PRL2蛋白均由1个为信号肽结构域和1个为Hormone 1结构域组成;黑鲷PRL1蛋白二级结构中α-螺旋占69.34%、无规则卷曲占30.66%,包含1个糖基化位点及37个磷酸化位点;黑鲷PRL2蛋白二级结构中α-螺旋占67.07%、无规则卷曲占32.93%,包含1个糖基化位点及21个磷酸化位点。黑鲷PRL1和PRL2基因在12个待检测组织中均有表达,且均以脑组织中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量（P<0.05,下同）;在盐度5‰处理组中,黑鲷PRL1基因在胁迫4h开始显著上调,黑鲷PRL2基因在胁迫8h开始极显著上调（P<0.01）,二者均在胁迫24h时达峰值,随后开始缓慢下降,至胁迫72h时其相对表达量仍显著高于对照组;在盐度25‰和35‰处理组中,黑鲷PRL1和PRL2基因在胁迫72h时其相对表达量均显著低于对照组。【结论】低盐胁迫能促进黑鲷PRL1和PRL2基因的表达,高盐胁迫则抑制黑鲷PRL1和PRL2基因的表达,即黑鲷PRL1和PRL2基因在其适应淡水环境的过程中发挥重要调节作用。