Ⅱ型胶原微图案化对猪关节软骨细胞行为的影响

[目的]明确调控生物材料表面拓扑结构对猪关节软骨细胞基础生长行为和功能的影响,为关节软骨组织缺损修复提供理论依据.[方法]利用食人鱼溶液(Piranha,H2O2:H2SO4)对普通玻片进行氧化,以紫外光刻法制备具有不同尺度条带微图案的Si印模,经氧气等离子体处理和II型胶原(COLII)浸润后,通过微接触印刷(μCP技术)将COLII固定在氧化玻片材料表面,将猪关节腔软骨细胞接种于微图案化的支架材料上,经37 ℃、5% CO2培养箱培养后采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法和二乙酸荧光素(FDA)荧光染色法分别观察软骨细胞的增殖生长情况.[结果]经食人鱼溶液处理后玻片表面羟基化程度提高,亲水性明显增强.通过μCP技术能成功将COLII印刷在羟基化玻片表面上,且条带均匀、整齐.将猪软骨细胞接种到构建的取向性COLII微图案材料上进行培养,发现COLII能为猪软骨细胞提供黏附位点,且取向性COLII微图案对软骨细胞的增殖生长有促进作用,但不同尺度(100、200和300 μm)线宽对软骨细胞的增殖生长存在明显差异,表现为线宽越宽,软骨细胞的增殖生长能力越弱.猪软骨细胞在COLII微图案材料上生长状况良好,随着培养时间的延长,软骨细胞多呈多边形;其软骨细胞培养效果优于无规则的涂覆COLII微图案材料.[结论]利用μCP技术成功构建的规整COLII微米级拓扑结构对猪关节软骨细胞的黏附铺展、增殖行为有促进作用,且线宽尺度与软骨细胞增殖生长能力呈反比趋势.即通过人为调控生物材料的表面活性拓扑结构,在一定程度上能有效调控或影响关节软骨细胞的生长行为.     

鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法,观察鹿茸软骨细胞在体外培养的生物学特性,为鹿茸再生机理的研究奠定基础;【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞,采用组织学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况;【结果】核心部分,约150字鹿茸软骨细胞贴壁生长,原代细胞比传代生长速度快,原代及传代4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增殖能力,软骨细胞呈三角形,多边形等多种形态,II型胶原免疫组化,甲苯胺蓝染色为阳性;【结论】体外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力,传代培养4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特性,可满足后续实验研究要求。     

兔耳廓软骨的体外培养及细胞特性研究

[目的]研究软骨发育与重建,建立软骨体外培养模式,[方法]通过改良组织块细胞培养法,进行家兔耳廓弹性软骨细胞的体外培养,研究其形态与生长特性。[结果]兔耳软骨组织16 h完成贴壁,1.5 d软骨细胞迁出,144 h细胞生长达到融合;传代兔耳软骨细胞12 h贴壁,生长特性与原代相似,但第3代细胞的延滞期长,在培养48 h开始进入对数期,培养第8天细胞数量达到峰值。HE染色结果表明弹性软骨细胞形态均匀,细胞呈圆形或椭圆形,核呈椭圆形,可见双核或多核现象。软骨陷窝和核深染,胞浆着色均匀。细胞分裂旺盛。同族细胞群清晰。[结论]原代及2代耳软骨细胞体外生长特性及细胞形态一致,培养条件稳定。     

应用同种异体大鼠脂肪干细胞的细胞外基质修复软骨缺损

取1周龄大鼠脂肪组织分离脂肪干细胞（Adipose derived stem cells,ADSCs）诱导分泌细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）,通过去细胞处理后得到生物支架ADSCs-ECM。使用2 mm的钻头在大鼠膝关节做直径2 mm、深2 mm的缺损;空白组不移植任何材料,试验组在软骨缺损处移植ADSCs-ECM支架材料。手术后6周和12周取材进行形态学观察和组织学分析。结果表明：处理12周后,缺损处空白组未见明显的软骨再生,而试验组可见明显的软骨再生,新生的软骨组织颜色与正常软骨组织颜色相似,且与周围正常软骨组织界面整合良好,再生软骨中有大量的软骨细胞产生。说明同种异体大鼠ADSCs-ECM在修复软骨缺损效果良好。     

白介素1β对大鼠软骨细胞炎症因子和ECM降解蛋白的影响

研究探讨白介素-1β(IL-1β)刺激大鼠软骨细胞不同时间后,对炎症因子环氧合酶(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)、软骨降解酶基质金属蛋白酶-血小板反应蛋白基序(ADAMTS-4)以及细胞外基质(ECM)降解蛋白硫酸软骨素846(CS846)和软骨寡聚蛋白(COMP)影响.试验通过体外培养大鼠软骨细胞,甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光方法鉴定软骨细胞.10 ng·mL-1 IL-1β分别刺激大鼠软骨细胞0、12、24和48 h后,Western blot方法检测软骨细胞COX-2和ADAMTS-4蛋白变化,ELISA方法检测细胞上清液中PGE2、CS846和COMP水平.结果表明,与对照组比较,IL-1β刺激软骨细胞COX-2、PGE2、COMP和CS846表达呈时间依赖性增加.ADAMTS-4在IL-1β刺激12和48 h时表达显著增加.研究发现,IL-1β刺激大鼠软骨细胞48 h内促进软骨细胞分泌ADAMTS-4、COX-2和PGE2蛋白,使关节软骨ECM发生降解,促进COMP和CS846含量增加并介导OA软骨退变.试验采用10 ng·mL-1 IL-1β对软骨细胞刺激0、12、24和48 h后检测相关炎症因子与ECM降解蛋白,为研究OA发生发展以及发病机制提供理论基础,实现对OA病情发展的评估,并为选择高效诊疗方案及相关药物提供依据.     

改良组织块法培养原代兔耳软骨细胞

通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单、经济、可行的兔软骨细胞系体外培养方法.从6只家兔耳缘同一部位取下6块软骨组织样,随机分为2组,改良组使用酶消化法结合组织块体外培养兔耳软骨细胞,对照组使用传统的组织块法,对比两种方法中组织块的贴壁、生长、分裂及增殖状况.与对照组相比,改良的组织块法中组织块贴壁时间从24h缩短至6h,贴壁后新生软骨细胞游离出的时间从48 h缩短至24h,软骨细胞的整齐度从92％提高至98％.(p＜0.05).改良的组织块法较传统的组织块法在软骨细胞培养中具有显著优势,适于建立简易的兔耳软骨细胞系体外培养方法.     

药用植物淫羊藿与富血小板血浆协同对软骨细胞的增殖作用

观察淫羊藿和富血小板血浆(PRP)对SD大鼠软骨细胞增殖作用的影响,探讨两者对软骨细胞的协同作用。取3周龄SD大鼠的膝关节软骨建立软骨细胞体外培养体系,分别采用MTT法、流式细胞术对细胞增殖作用进行检测。结果表明: (1) PRP对软骨细胞增殖有显著的促进作用(P<001);(2)淫羊藿对软骨细胞有一定的增殖作用,但不显著;(3)淫羊藿联合PRP对软骨细胞的增殖作用显著下降,效果低于淫羊藿或PRP组(P<001)。淫羊藿联合PRP对软骨细胞有显著抑制作用(P<001),推断淫羊藿某些成分抑制了PRP中生长因子的活性,从而减弱了PRP对软骨细胞的作用,该推断有待进一步研究确认。     

利用骨髓基质细胞与丝素蛋白修复缺损髁突软骨的研究进展

利用丝素蛋白作为支架、骨髓基质细胞作为种子细胞的组织工程技术,修复缺损的髁突软骨是目前髁突软骨修复的最新方法。此方法改变了传统骨质缺损修复模式,通过体外培养骨骼组织再植入体内的方式,可以达到理想的效果。查阅了有关丝素蛋白生物材料及诱导骨髓基质细胞分化为软骨细胞的研究文献,综述了将二者结合起来的组织工程技术修复缺损髁突软骨组织的途径和成果及利用骨髓基质细胞与丝素蛋白修复缺损的髁突软骨的现状和进展。     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

雌激素与尼古丁对软骨细胞基质代谢影响

雌激素和尼古丁是2种对骨关节炎发病有影响的重要因素,但其影响的具体分子机制仍然存在争议。本研究旨在探讨这2种因素单独和叠加对软骨细胞代谢的影响,从而为骨关节炎的发病机制研究提供一定的参考。鼠胚胎瘤来源的软骨前体细胞系ATDC5在进行铁硒传递蛋白ITS定向诱导能够分化为软骨细胞。研究中对诱导后获得的软骨细胞用雌激素及尼古丁进行了处理。处理后细胞胞外基质蛋白聚糖和二型胶原表达水平分别用甲苯胺蓝染色和免疫组化进行检测,蛋白表达水平和mRNA水平分别进行了Western blot和Real-time PCR验证。研究结果显示尼古丁会造成软骨细胞2种胞外基质分泌的降低,并且促进分解酶MMP13的表达,抑制合成相关蛋白BMP-7的表达。而雌激素能够通过抑制分解酶MMP13和促进基质合成相关蛋白BMP-7的表达来挽回尼古丁对软骨细胞胞外基质的破坏作用。但在mRNA水平,与仅用尼古丁处理相比,雌激素会同时促进mmp13和bmp-7的表达,推测是因为雌激素增强了细胞的代谢效率。这些结果表明,雌激素对受到尼古丁影响的软骨细胞具有保护作用,这可能是骨关节炎初期防治的一个潜在治疗方案。     

海带多糖抑制平滑肌细胞增殖及抗氧化活性研究

【目的】研究海带多糖对H_2O_2诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖及胞内脂质过氧化物生成量的影响,为阐明海带多糖对VSMC的作用机制奠定基础。【方法】以H_2O_2为诱导剂建立体外VSMC增殖模型,通过四甲基偶氮唑盐法和细胞形态观察评价海带多糖对H_2O_2诱导VSMC生长和增殖的影响,同时以丙二醛为指标考察海带多糖对H_2O_2诱导VSMC胞内脂质过氧化物生成量的影响。【结果】以50μmol·L~(-1) H_2O_2为诱导剂建立VSMC体外增殖模型。四甲基偶氮唑盐法测定结果表明海带多糖对H_2O_2诱导VSMC增殖具有显著抑制活性,最大增殖抑制率达到73.56%。细胞形态学观察结果表明海带多糖作用下H_2O_2诱导的VSMC生长状态发生改变且细胞数量显著减少。丙二醛检测结果表明海带多糖作用下VSMC胞内脂质过氧化物量显著减少。【结论】海带多糖能够抑制H_2O_2诱导的VSMC增殖,且显著降低VSMC胞内脂质过氧化物生成量。     

软骨组织切片不同制作方法的比较

采用正丁醇脱水及脱钙处理制作软骨石蜡切片和冰冻切片,并用阿利辛蓝、甲苯胺蓝和Masson三色法对软骨细胞进行特异性染色,对软骨切片制作方法进行了比较研究.结果表明,软骨组织改良石蜡切片优于普通石蜡切片;冰冻切片较石蜡切片快速、简便,但保存时间短;石蜡切片操作复杂、时间长,但切片保存效果较好.3种染色方法对软骨细胞均能特异性着色.由此证明,使用冰冻切片和阿利辛蓝、甲苯胺蓝和Masson三色染色法可以制作良好的软骨组织切片.     

荷斯坦牛脐带间充质干细胞分离鉴定及分化研究

动物干细胞作为重要遗传种质资源和再生医学的可行性资源，拥有广阔研究和应用前景。对荷斯坦牛脐带细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）进行分离、鉴定，并对其多向分化潜能等生物学特性进行研究。取3月龄健康荷斯坦牛胎牛脐带，采用Ⅳ型胶原酶分离细胞进行体外培养，获得的细胞贴壁后呈长梭形，生长曲线呈典型的“S”形，群体倍增时间随着代次的升高逐渐下降。免疫荧光和RT-PCR的检测结果都表明，分离的细胞中CD29、CD73、CD90、CD166均阳性表达，而CD45不表达。成脂肪诱导后，可见被油红染色液染色的脂滴，成脂肪关键基因LPL和PPAR-γ都阳性表达；成骨诱导分化后，可见被茜素红染色的钙结节，其表达成骨关键基因骨桥蛋白OPN和Ⅰ型胶原蛋白基因COL-Ⅰ；成软骨诱导分化后，可见被阿利新蓝染色的软骨组织，表达成软骨细胞关键基因转录因子基因SOX9和ACAN。成功从3月胚龄的荷斯坦牛脐带中分离出其具有良好的增殖活力及成脂肪、骨和成软骨能力的间充质干细胞，可为动物种质资源保存和再生医学提供依据和潜在可利用细胞资源。     

胚胎干细胞体外定向诱导分化研究进展

胚胎干细胞是由早期内细胞团分离的一种多潜能细胞 ,在体外分化抑制培养时 ,可保持未分化状态而无限增殖。一旦撤除分化抑制因素 ,或添加适当的诱导剂 ,ES细胞可分化为内胚层、中胚层和外胚层的多种类型的特化细胞。文章综述了体外定向诱导 ES细胞分化为造血细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞、软骨细胞和黑素细胞等的途径和方法。     

青年猪骨软骨病病理组织学变化与分类

研究了265头青年猪1 060个关节(附关节和腕关节各530个)骨软骨病的病理组织学变化.肉眼观察主要表现为患部关节软骨变色、充血,关节面粗糙、裂开、糜烂或凹陷,并根据其损伤程度进行分类,即正常、轻度、中度和严重,分别占21.7%、33.3%、29.0%、16.0%.显微观察特征为关节软骨局部增厚,软骨细胞增生、肥大;在一些区域软骨细胞变性、坏死,坏死区易形成裂隙;骨质内形成软骨岛.结论:青年猪有很高的骨软骨病发病率,后肢比前肢严重,并表现典型的骨软骨病组织病理学特征.     

青年猪骨软骨病病理组织学变化与分类

研究了265头青年猪1 060个关节(附关节和腕关节各530个)骨软骨病的病理组织学变化.肉眼观察主要表现为患部关节软骨变色、充血,关节面粗糙、裂开、糜烂或凹陷,并根据其损伤程度进行分类,即正常、轻度、中度和严重,分别占21.7%、33.3%、29.0%、16.0%.显微观察特征为关节软骨局部增厚,软骨细胞增生、肥大;在一些区域软骨细胞变性、坏死,坏死区易形成裂隙;骨质内形成软骨岛.结论:青年猪有很高的骨软骨病发病率,后肢比前肢严重,并表现典型的骨软骨病组织病理学特征.     

荔枝、龙眼胚性愈伤组织的细胞组织学观察

通过石蜡切片观察荔枝、龙眼胚性愈伤组织的结构和胚性细胞分裂生长的方式 .结果表明 :荔枝胚性愈伤组织中具有旺盛分裂能力和再生能力的胚性细胞主要分布在外缘 ,胚性愈伤组织的增殖生长为单细胞外起源 ;而龙眼胚性愈伤组织的胚性细胞大多处于内部 ,胚性愈伤组织的增殖生长为内起源 .还对荔枝、龙眼胚性愈伤组织应用于遗传转化等问题进行了探讨     

3D与平面培养条件下马鹿茸间充质干细胞的生长特性比较

细胞体外3D培养技术更有利于细胞功能的表达和发挥,是细胞组织工程的重要研究内容。马鹿鹿茸间充质干细胞(MSCs)是一种新发现的成体干细胞,具有向软骨分化的能力。【目的】为了深入研究鹿茸MSCs细胞特性及软骨分化机制,【方法】利用水凝胶为支撑材料进行3D培养,与细胞平面培养方式对比,分析鹿茸MSCs的生长特性与变化。【结果】结果表明,3D培养组生长呈团状,形态呈梭型。两种培养法细胞生长曲线相似,培养至48 h后细胞进入对数生长期,平台期即培养144 h之后3D培养组细胞密度显著高于平面培养组(p0.05);对两种方法培养312 h(13 d)的细胞进行PI染色,3D培养组细胞凋亡率(32.67±11.08%)低于平面培养组(37.18±10.21%),但两组间没有显著差异。     

胶原作为生物医学材料的应用研究

胶原是生物体内的一种纤维蛋白,由于其较高的抗张强度,目前被广泛用于生物医学领域。该文主要介绍了胶原作为组织工程支架材料和药物释放载体材料的应用。