白菜核雄性不育两用系花蕾的mRNA差别显示及其cDNA差异片段分析

用mRNA差别显示技术对白菜核雄性不育两用系中不育株群与可育株群花蕾总RNA进行了比较分析.在6种反转录模板和20种差异随机引物共120种组合的选择扩增中共回收了18个cDNA差异片段,对其中6个cDNA差异片段进行Northern验证,获得了一个白菜核雄性不育两用系可育株群并在花蕾中特异表达的阳性差异片段,简称为B0302-4.Northern验证结果表明它在不育株中的表达受到了明显的抑制,其长度为463 bp.经GenBank BLAST查询,它与拟南芥第一条染色体上编码细胞色素P450的基因CYP86C4核苷酸序列有84.3%的同源性.     

白菜雄性不育相关新基因BcMF1的分离及特征分析

【目的】筛选与白菜雄性不育性状相关的新基因,为研究植物雄性不育的分子机制提供依据。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析白菜核雄性不育两用系‘ZUBajh97-01AB ’的表达差异,在可育株群中扩增出1条特异条带BcMF-A15T17,通过RACE和PCR技术扩增得到该基因的cDNA和DNA全长序列,并用Northern杂交验证了该基因的表达特征。【结果】该基因被命名为BcMF1,它的cDNA全长为1 684 bp,基因全长为1 985 bp,BcMF1基因仅在两用系可育株群的中、大花蕾中特异表达。推测的BcMF1蛋白含有471个氨基酸,与拟南芥未知功能蛋白家族DUF1216成员的相似性较高,预测该蛋白是一个定位在胞外的分泌蛋白。【结论】BcMF1基因是一个与白菜细胞核雄性不育相关的新基因。     

大白菜CMS雄性不育发生相关基因的克隆与分析

【目的】筛选和克隆与大白菜CMS雄性不育相关的应答基因。【方法】以大白菜不育系06J45和恢复系01S325-1为材料,利用cDNA-AFLP方法从F2S5群体不育株和可育株花蕾中筛选分离差异表达基因,通过RACE技术对该差异表达基因进行克隆,对基因序列进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR定量分析不育株和可育株花蕾发育过程中基因表达的变化。【结果】在F2S5可育株花蕾cDNA混合池中扩增出1条特异表达条带,通过3′RACE和5′RACE克隆得到相应的BrUP基因,全长1 407bp,编码403个氨基酸残基。生物信息学分析表明,BrUP基因与大白菜Bra007268基因序列相近,由6个外显子和5个内含子组成,与拟南芥未知功能基因AT3G56750同源,一致性达90%。保守结构域分析表明,BrUP基因可能是1个具有跨膜结构的O-型岩澡糖基转移酶基因,主要功能是进行糖基化修饰。qRT-PCR定量发现,BrUP只在花蕾发育早中期表达,且在大白菜不育株花蕾发育早期其表达量显著性下调。【结论】成功筛选克隆获得1个与大白菜雄性不育发生相关的功能未知基因BrUP。     

大白菜快速碱化因子BrRALF1的克隆与特征分析

利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育"两用系"AB02可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异表达条带TDF-3,通过RACE和RT-PCR技术克隆了该基因的cDNA全长序列.序列分析表明,该基因编码大白菜快速碱化因子,被命名为BrRALF1;BrRALF1全长cDNA序列为551bp,编码1个包含79个氨基酸残基的前体蛋白;前体蛋白N末端1～28位为信号肽,成熟蛋白含有保守的YIXY结构域、YXRGC结构域和4个半胱氨酸残基;预测BrRALF1蛋白含有5个翻译后修饰性位点.表达模式分析表明.BrRALF1在可育花的花丝、花药、雌蕊、萼片、花瓣中均表达,其中在花药中表达量最高;BrRALF1表达在不育株上受到强烈抑制.     

大白菜果胶甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析

 【目的】克隆大白菜果胶甲酯酶基因,为进一步探讨果胶代谢在大白菜育性调控中的分子机制提供帮助。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-24,通过RACE技术扩增该基因的cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,利用荧光定量PCR技术分析基因时空表达模式。【结果】该基因编码大白菜果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11),被命名为BrPME1(GenBank登录号：HM185497)。BrPME1全长cDNA序列为1 290 bp,编码1个包含363个氨基酸的前体蛋白。BrPME1蛋白N末端1—23位为信号肽,成熟蛋白含有保守的果胶甲酯酶酶活结构域,而不含酶活抑制位点。预测BrPME1蛋白含有10个磷酸化位点、1个酰胺化位点和6个N端豆蔻酰基化位点。BrPME1在两用系不育株花蕾中表达量很低,在可育株的大花蕾以及成熟花药中高水平表达。【结论】BrPME1是一个受大白菜细胞核雄性不育基因抑制的果胶甲酯酶基因家族成员。     

玉米温光敏雄性不育系9417叶片叶绿体蛋白质差异分析

对玉米温光敏感雄性不育-可育 “两用系”9417的不育型和可育型叶片中的叶绿体蛋白质组进行研究，试图找出不育型与可育型的差异蛋白,确定导致不育的蛋白。利用SDS PAGE凝胶电泳，对玉米雄性不育 可育“两用系”不育型与可育型8叶期功能叶叶绿体蛋白质组中的差异蛋白进行分析。结果表明，不育型与可育型存在3条蛋白差异条带，其中No.1条带为不育型中新出现的蛋白质条带，而其余两条条带只在表达丰度上有差别。利用MALDI TOF MS方法，运用MASCOT软件于NCBI数据库中进行数据查询，结果显示No.1条带中含有3种蛋白质，而这3种差异蛋白的出现可能与玉米不育性有关。     

水稻滇一型不育系及保持系花药mRNA差异显示*

 运用mRNA差异显示技术,对水稻滇一型雄性不育系和保持系花药基因表达差异进行了比较研究。以专门设计用于差异显示的90对PCR引物组合,分析滇一型10对不同品系的不育系和保持系花药基因表达差异。结果表明:这90个引物组合均有扩增产物,扩增的cDNA片段在100～2000bp之间;不育系和保持系花药cDNA扩增带型相似。在这90个引物组合中仅有15对引物组合在单对的不育系和保持系间显示多态性,而且大多数的多态性引物组合仅扩增出一条差异带。在所找到的差异中,一般总是保持系有一条带,而不育系没有对应的带或是一条很弱的带。该结果表明不育系和保持系花药mRNA差异很少。所幸的是,在这些引物组合中,只有T8×P1引物组合(5′-ATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTG×5′-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3′)在10对不育系和保持系间扩增出一个共同的差异cDNA片断:保持系在750~1000bp之间有一条带,而不育系没有对应的带或是一条表达很弱的带,这很可能就是保持系和不育系的育性基因表达差异的结果。     

白菜细胞核雄性不育两用系的性状比较分析

用比较分析的方法，对白菜核雄性不育两用系中不育株与可育株的植株性状、育性、花器结构和花粉扫描电镜形态等进行观察研究，结果表明：白菜核雄性不育两用系中不育株花粉败育彻底，不育株与可育株呈1：1分离，是一种稳定可靠的核雄性不育两用系；对不育株与可育株花蕾总蛋白进行了SDS-PAGE凝胶电泳，发现不育株与可育株都有各自的一条特异蛋白条带，分别命名为A-1和B-1，两者的表达量都比较高。     

甜瓜雄性不育两用系转录组测序与激素含量研究

为了从分子及生理生化水平探讨甜瓜雄性不育发生过程中内源激素(生长素、赤霉素、茉莉酸、水杨酸)与花粉败育的相关性,利用雄性不育两用系对甜瓜可育株与不育株2 mm花蕾雄蕊进行转录组测序,筛选内源激素相关差异表达基因,结合实时荧光定量分析以鉴定差异基因表达量,并对雄性不育株与可育株的花蕾内源激素含量进行测定。结果显示:转录组测序共发现334个差异表达基因,对差异表达基因进行GO功能分析显示,共有273个基因归属于生物合成、分子功能和细胞组分三大分支,其中与内源激素相关的差异基因为7个,其中2个差异表达基因为水杨酸甲基转移同源基因,3个为生长素相关表达基因,赤霉素相关表达基因和茉莉酸相关表达基因各1个;qRT-PCR验证表明,与生长素相关的基因和吲哚-3-乙酸合成相关基因在雄性不育株花蕾中的表达量均高于可育株的表达量,而赤霉素、茉莉酸和水杨酸相关表达基因在雄性不育株花蕾中的表达量则是低于可育株中的表达量。激素含量的测定结果显示赤霉素和生长素含量可育株高于不育株,茉莉酸甲酯与水杨酸的含量不育株高于可育株。研究结果表明植物激素类相关基因通过间接方式参与雄性不育发生过程,同时多个激素基因之间存在相互拮抗,代谢途径复杂;茉莉酸甲酯和水杨酸含量过度积累可能与雄性不育的发生相关。     

光温敏雄性不育玉米9417雄穗幼穗期叶片叶绿体蛋白质差异分析

为了研究玉米"两用系"9417雄穗不育的分子机制,以玉米光温敏雄性不育系9417的不育和可育2种状态的植株为材料,利用SDS-PAGE、质谱和生物信息学等技术,对其幼穗分化敏感期叶片中叶绿体差异表达蛋白质组进行分离和鉴定。电泳图谱显示,光温敏雄性不育、可育株在雄穗分化发育敏感时期叶绿体表达蛋白至少存在4条显著的差异条带,其中No.1、No.2是可育株中存在而不育株缺失的条带;No.3、No.4是不育株存在可育株中缺失的条带。质谱分析共鉴定出4种蛋白质:①AOL_s00004g466、②luc7-like protein 3-like、③putative T3SS effector EspN2-2、④ABC transporter ATP-binding protein。可育株中No.1为假定蛋白,No.2蛋白的U1-snRNP成分在RNA的加工和修饰中起介导自身与帽结合蛋白相结合的作用;不育株中No.3蛋白具T3SS效应,No.4蛋白在膜上ATP结合区域具单向转运底物的作用。叶绿体出现差异蛋白质,可能与雄性败育、不育有关。     

Differential Expression Analysis of Genic Male Sterility A/B Lines in Chinese Cabbage-Pak-Choi(Brassica Campestris ssp. chinensis Makino)

To determine differential expression of genic male sterility A/B lines in Chinese cabbage-pakchoi (Brassica campestris ssp. chinensis Makino var. communis Teen et Lee), we used the RNA fingerprinting technique, cDNA-AFLP analysis, in different developmental stages and different tissues. While no obvious differential expressions were observed in rosette leaves, florescence leaves, and scapes, some differential expressions were found in alabstrums of A/B lines and among leaves, scapes and alabstrums. We analyzed the alabstrums collected in different developmental stages with 10 primer combinations. We got a unique band between middle size alabstrums and large alabstrums in B line in one of the ten pair primers, and in another one pair, one band reflecting a higher gene-expression level in A line than that in B line was obtained. No unique bands were found with the other primer combinations. The bands reflecting different gene-expression level were confirmed by Northern hybridization. The results indicated that cDNA-AFLP was a suitable tool for studying differential expression of genic male sterility in plants. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis patterns of soluble proteins further verified the difference in A/B lines.     

应用AFLP标记筛选甘蓝型油菜R4和22B的多态性

应用AFLP分子标记,对甘蓝型油菜恢复系R4和保持系22B进行引物多态性筛选。在414对AFLP引物中,初步筛选到有多态性的引物组合147对;其中重复性好、多态性比率高的引物组合120对;每对引物可扩增出50条左右的条带,其中,多态性条带数为12.4条。AFLP是构建图谱中效率较高的分子标记。     

花生DNA分子标记的研究Ⅲ不同限制酶组合AFLP分析效果比较

采用了28对EcoR I/Mse I AFLP选择性扩增引物、64对Pst I/Taq I AFLP选择性扩增引物,对 作图亲本24-3、B4及其杂种F1进行了分析,统计了两种限制酶组合的扩增总带数、多态性带数及多 态性率。秩和检验结果说明,两种限制酶组合AFLP每对引物扩增出的总带数无显著差异,而多态性条 带数目以及多态性率均有极显著的差异。证明尝试不同的限制酶组合可望揭示出花生品系材料间更 为丰富的遗传变异性。     

辣椒细胞质雄性不育恢复基因的AFLP标记

采用AFLP技术对辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的恢复系湘紫基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物PstⅠ-NNN+MseⅠ-NNN组合,有58对引物组合在两系间扩增出5156条带,多态性位点为4个,主要表现为条带数目、条带位置和条带强弱的差异。其中在恢复系材料中仅有3个多态性片断,找到了辣椒细胞质雄性不育恢复系湘紫基因组DNA特异的AFLP片段ACA/CGC300、AGT/GGT375和AGC/CGC380,并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育恢复系中的作用进行了讨论。     

白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化#br#

【目的】寻找与白菜叶缘裂刻发育相关的表达基因,了解叶缘裂刻调控的分子机理。 【方法】应用cDNA-AFLP技术从 mRNA 表达水平研究白菜叶全缘和裂刻近等基因系间基因表达的差异。【结果】共获得 57 条差异片段,合并归属于 55 条非重复序列,其中在叶全缘株系中增强或特异表达的有 25 条,叶裂刻株系中增强或特异表达的有 30 条。54 条差异片段可以在 NCBI 数据库中找到同源序列(包括 EST)、其中42 条为已知基因,1条没有找到同源序列。按照其参与的生物学途径归类,已知基因片段参与了代谢、转录、细胞囊泡运输、蛋白质合成和降解、蛋白质储藏与运输、信号传导、光合系统、基因转座等相关过程。用 AFLP 转化的 SCAR 标记在分离群体上验证结果表明,SEL7B16-SCAR 检测片段的表达模式与 cDNA-AFLP 结果一致。【结论】构建了白菜叶缘裂刻发育调控基因表达谱,识别了与已知NAC036、DP-2、MYB77、TCP24 参与调控裂刻发生基因密切相关的片段。基于cDNA-AFLP特异序列,开发了1条与裂刻紧密连锁的 SCAR 标记,命名为SEL7B16-SCAR,可用于裂叶纯合和杂合的分子辅助选择。