鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead, SSN-1),对发生细胞病变(cytopathic effects, CPE)的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV).试验结果表明:在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒.负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV.对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验(氯仿处理)、热敏感试验(55℃ 30min)、酸碱敏感试验(pH值为3和pH值为11各1h),试验结果表明:石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感.研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV.     

6株鱼类病毒性神经坏死病病毒cp基因的分子特征和遗传发生分析

根据已报道的鱼类病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV)衣壳蛋白基因(coat protein gene, cp基因)设计引物,对2006年从我国沿海养殖石斑鱼中分离到的6株鱼类神经坏死病毒进行RTPCR扩增,特异性扩增出6株病毒的完整衣壳蛋白基因,分别连接到pMD18-T载体中,并进行序列测定和分析.结果发现,6个VNNV分离株的cp基因核苷酸序列的同源性在97.3%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%～99.1%之间.根据cp基因核苷酸序列绘制分子进化树,发现6个VNNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒(ECNNV)、巨石斑鱼神经坏死病病毒(ETNNV)及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒(MGNNV)亲缘关系较近.试验结果表明,目前我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中广泛传播流行.     

福建南部养殖石斑鱼暴发性疾病流行调查

近年来福建南部网箱养殖石斑鱼常暴发急性传染病,经试验确认的传染病病原有神经坏死病毒、微孢子虫、本尼登虫以及多种弧菌.由神经坏死病毒引起的病毒性神经坏死病表现典型的神经症状,中枢神经组织和视网膜细胞严重空泡坏死;微孢子虫病表现为腹部、生殖腺、肝脏、肌肉等组织寄生大量孢子囊;本尼登虫主要寄生于石斑鱼的体表;感染的细菌主要有溶藻弧菌、副溶血弧菌以及河流弧菌等10种,这些菌多为条件致病菌.调查结果表明,病毒性神经坏死病是该地区养殖石斑鱼最常见危害也最大的传染病.     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒地方株的分离及RT-PCR鉴定

自疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血液中分离得到一株不产生细胞病变的病毒,经双抗体夹心ELISA检测及RT-PCR扩增进一步证实该病毒为牛病毒性腹泻-粘膜病病毒。     

1株犬细小病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

采集一疑似犬细小病毒(CPV)患犬的粪便,采用胶体金试纸条和PCR方法对病料进行CPV检测,并应用猫肾细胞F81进行病毒分离培养,分别采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)和PCR检测病毒在F81细胞中的增殖动态,采用无血清培养和有血清培养2种方法进行体外培养,IPMA测定病毒滴度。利用PCR扩增分离病毒的VP2基因,经序列测定后采用DNAStar 7.0和MEGA 5.0软件进行生物信息学分析。结果表明,胶体金试纸条检测为CPV抗原阴性,PCR检测结果为CPV核酸阳性,病料接种到F81细胞培养后出现明显细胞病变(CPE),血清学鉴定为CPV抗原阳性,将分离得到的病毒命名为CPV-NY130615。IPMA可从感染后6 h的F81细胞中检出病毒,PCR能从感染后6 h培养上清中检出CPV核酸。血清同步接种培养法培养和无血清单层接种培养法培养的第15代病毒滴度分别为1×108.06TCID50/m L和1×107.65TCID50/m L。序列测定分析表明,该毒株VP2基因开放阅读框(ORF)为1 755 bp,编码584 aa。进化分析显示,该毒株属于CPV-2a型。     

绵羊痘病毒的分离及双抗夹心法ELISA的建立

为了检查现有疫苗与山西北部舍饲羊群所患病是否匹配,以及更好地研究羊痘病毒和研制新型疫苗,对2009年山西北部绵羊群发生的疑似绵羊痘进行了病毒分离及ELISA检测研究。取疑似绵羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液,接种2月龄绵羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变。病毒悬液接种10日龄鸡胚绒毛尿囊膜,未出现痘斑。收获产生病变的细胞培养物,继而利用双抗夹心法ELISA检测羊痘病毒,并确定其病毒含量。结果表明,所分离的病毒为绵羊痘病毒,样品OD值平均为0.156,浓度为2.5 IU.L-1,接近于标准品(2号)。本研究为今后研制新型羊痘疫苗奠定了基础。     

一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化

为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在猪用活疫苗生产过程中的污染情况,利用抗原捕获ELISA方法对用于制作原代睾丸细胞的犊牛血清进行检测。将检测结果为阳性的1份犊牛血清,接种于MDBK细胞上,盲传3代,出现明显细胞病变。用BVDV 5′-UTR端特异性引物进行RT-PCR扩增,并对扩增片段进行克隆测序和序列分析。结果表明,分离得到一株2型牛病毒性腹泻病毒,并将其命名为JN-2。将该病毒用蚀斑方法进行克隆纯化,并对纯化前后病毒的TCID50进行测定比较,结果发现纯化后病毒滴度显著提高。     

犬瘟热病毒水貂株的分离与鉴定

从疑似犬瘟热病死水貂的肝脏中分离出1株病毒,并进行了系统的鉴定。结果表明:该毒株接种于Vero传代细胞后,出现了典型而有规律的病变;其病毒理化特性与犬瘟热病毒相同;致细胞病变作用可被兔抗CDV阳性血清阻断;间接免疫荧光试验表明接种病毒的BHK-21细胞出现特异性的亮绿色荧光,而正常细胞则未见绿色荧光;对提取接种病料后的Vero细胞培养物中的总RNA进行RT-PCR扩增,得到了324bp和1053bp的目的片段,证明该毒株为CDV。     

抗兔病毒性出血症病毒单克隆抗体的制备

通过抗兔病毒性出血症病毒(RHDV)杂交瘤细胞株的筛选,其中一株连续克隆3次,在培养瓶中传代1个月,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定,分泌单克隆抗体(McAb)性能稳定。杂交瘤细胞株的小鼠腹水滴度为1:1600～1:3200。利用McAb腹水作一抗,经免疫荧光检测RHDV感染的细胞片,可发现细胞核内有特异性荧光颗粒,滴度为1:200。杂交瘤细胞株染色体的分析,染色体数在98±10,符合杂交瘤细胞株的特征。经琼脂扩散法对McAb亚类的分析测定结果与抗鼠IgG和IgG_3出现沉淀线。