魏可葡萄气生根发育的转录组分析

葡萄气生根是在高温高湿环境下老蔓上发育形成的一种特殊根系类型,发育程度较低,具有分化潜力。通过技术手段诱导魏可葡萄当年生结果枝茎节处萌发气生根,以同一结果母枝未处理茎节为对照进行根系转录基因表达情况分析,结果表明,诱导气生根发育过程中有3 989个基因表达量上升,2 830个基因表达量下调。采用GO功能分类,可将注释的基因划分为40个功能类别,包括催化活性、结合和代谢过程等。部分根系关键基因表达结果表明,生长素、赤霉素、脱落酸在内的所有植物激素都参与了调控过程,结合生长素下游相应基因分析,内切葡聚糖酶基因、PRE基因和高亲和力硝酸盐转运体基因在气生根发育过程中显著上调表达,表明降解茎节处表皮细胞壁、利用硝酸盐在茎节处富集刺激根芽萌发是气生根生长发育调控机理之一。     

花生生长素响应因子基因AhARF3的克隆与表达分析

生长素响应因子(auxin response factor, ARF)是调控生长素响应基因表达和信号转导的一类转录因子,在植物生长发育的各个阶段均起重要的调节作用。本研究基于花生种子萌发前后转录表达差异分析,克隆到1个生长素响应因子基因AhARF3。序列分析结果显示,该基因的ORF区为2 115 bp,编码704个氨基酸,推测相对分子量为72.92 kD,等电点6.86。不同器官表达谱分析结果显示,AhARF3为组成性表达,茎中的表达量最高,根与花中的表达量较低且近似,干种子中最低。种子萌发过程的表达分析显示,萌发10～72 h的种子中AhARF3表达量均比干种子中极显著增加,尤其是萌发48～72 h,AhARF3的表达水平不仅比萌发前期各阶段种子中的大幅上调,与根、茎、叶、花及各发育阶段的种子相比,也具有明显的表达优势。     

MAPK调节水稻幼苗根系生长的分子机制

以水稻品种中花11号为材料,利用MAPKK抑制剂PD(PD 98059)分析了MAPK信号对水稻根系生长、H2O2产生、生长素积累分布及生长素和细胞周期基因表达谱的影响。结果表明,PD处理促进了初生根和不定根的伸长生长,但抑制了侧根的形成和发育,并诱导了H2O2的产生和生长素的积累增加。分子水平分析显示,PD处理分别使14个生长素基因和12个细胞周期基因表达上调,使3个生长素基因和7个细胞周期基因表达下调。这些结果说明在正常条件下,MAPK对水稻幼苗根系生长的调节与其控制H2O2产生和生长素平衡及调控生长素和细胞周期基因表达有密切关系。     

两个小麦甲基结合蛋白基因cDNA全长克隆及其在种子中的表达特性

 【目的】分析小麦甲基结合蛋白基因TaMBD1和TaMBD6的序列特征及其在种子形成和萌发过程中的表达模式,为探讨小麦种子形成及萌发过程中的表观遗传学调控机制积累资料。【方法】利用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并通过半定量RT-PCR分析克隆基因在小麦种子不同发育阶段及萌发过程中的表达模式。【结果】获得了小麦甲基结合蛋白基因TaMBD1和TaMBD6的cDNA全长,可分别编码193和187个氨基酸。氨基酸序列分析发现,TaMBD1和TaMBD6均包含有典型的甲基结合域,TaMBD1还包含1个CW型的锌指结构域。三维结构分析显示,TaMBD1和TaMBD6均可形成由β-折叠、α-螺旋及C-端扭曲共同构成的特定夹层结构。表达特性分析表明：TaMBD1在种子发育过程中一直保持有较高水平的稳定表达,而在萌发过程中呈现出有规律的表达动态,即胚中的表达量逐渐增强,胚乳中的表达量却逐渐减弱;TaMBD6在种子发育过程中呈现出先升高后降低的表达趋势,以开花后15 d时表达量最高,但在种子萌发过程中却未检测到其表达。【结论】首次克隆了小麦甲基结合蛋白基因TaMBD1和TaMBD6的cDNA全长,这2个基因的编码蛋白均包含有与DNA互作的典型功能域;通过对这2个基因在种子发育及萌发过程中的表达特性分析表明,TaMBD1在小麦种子的发育及萌发过程中均发挥重要调控功能,而TaMBD6仅与种子发育过程中的基因表达调控有关;研究结果为进一步探讨小麦种子形成和萌发过程的基因表达调控机制提供了重要信息。     

黄瓜生长素反应因子(ARF)家族鉴定及表达特异性分析

【目的】鉴定黄瓜生长素反应因子（ARF）,预测small RNAs并验证ARF与small RNAs和生长素的关系;分析ARF在种子萌发过程中的表达模式,推断ARF在黄瓜单性结实和种子萌发过程中是否起到关键作用。【方法】利用拟南芥和水稻ARF蛋白质序列检索黄瓜基因组数据库,对检索到的黄瓜ARF家族进行结构分析和small RNAs预测;将预测到的gma-MIR160o precursur构建到pCAMBIA2301植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其导入到单性结实黄瓜品种中,并对PCR检测为阳性的转基因植株进行RT-PCR验证;利用real-time RT-PCR方法分析ARF家族成员在生长素诱导后、开花时期及种子萌发阶段的表达模式。【结果】通过与拟南芥和水稻ARF蛋白序列的比对,共得到18个黄瓜ARF蛋白质序列。将其连同拟南芥和水稻的ARF蛋白质序列共分为4大类。从结构上看,外显子数目2-18不等,但同一类之间基因结构较为相似。进化树分析显示,18个基因之间的相似性不高;18个黄瓜ARF基因均有相对应的small RNA。其中, Csa010564、Csa011935、Csa015176、Csa020560和Csa022361可能都是miR160的靶基因。转基因试验进一步说明Csa010564、Csa011935和Csa015176在表达量上出现下降趋势,而Csa020560和Csa022361的表达量与对照相比略有上升,说明Csa010564、Csa011935和Csa015176是miR160的靶基因;在生长素诱导表达的试验中,Csa007296、Csa011935和Csa015176在根、茎和叶中的表达量均高于对照,说明ARF的表达受IAA的正调控;同时,以上3个基因在叶片和雌花花冠中的表达量均是开花第2 d低于开花当天,而在子房中的表达量确是第2天高于开花当天,尤其是Csa011935和Csa015176上调显著,说明ARF在子房发育过程中起到至关重要的作用;ARF在种子萌发过程中的表达分析显示：大部分基因在吸涨后12 h和48 h处于表达最高峰。【结论】ARF受生长素和相应的small RNAs调控。在黄瓜单性结实和种子萌发过程中,ARF可能起到了关键性作用。     

OsCtBP-A基因过量表达和RNAi沉默对水稻根系生长和抗性的影响

为了阐明己克隆的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的功能,构建了该基因的过量表达和RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴愈伤组织,分别获得了45个过量表达和75个RNAi 沉默T0代转基因植株,并进行了PCR和GUS染色鉴定。T1代过量表达株OsCtBP-A基因表达量明显增加,苗期根系生长增加,对水稻白叶枯病抗性无明显变化;而基因沉默株OsCtBP-A基因表达量显著下降,苗期根系发育迟缓,抗旱性明显降低,抗病性减弱。表明OsCtBP-A基因的表达可能对水稻苗期根系发育、抗旱性和抗病性具有不同程度的调控作用。     

葡萄SVP类MADS-box基因的克隆及表达分析

从无核白葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)中克隆获得一个胚珠发育相关MADS-box基因。该基因cDNA全长1 248bp,ORF为729bp,编码一个含有243个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对和系统发育分析显示,该基因属于SVP类MADS-box基因。采用半定量技术进行表达分析表明,该基因在葡萄的根、茎、叶、花蕾、盛花和胚珠中均有表达,但是有强弱差异。实时定量PCR技术分析表明在无核葡萄品种无核白胚珠发育过程中基因表达量先升后降,而在有核葡萄品种黑比诺胚珠发育过程中表达量一直呈下降趋势。     

毛果杨PtrMYB161基因在木质部发育中的表达调控

木材形成是一个复杂的发育过程包括维管形成层分化形成次生木质部以及木质部中细胞壁的加厚等,其中MYB家族转录因子在此过程中发挥着重要调控作用。通过RNA-seq对毛果杨(Populus trichocarpa)基因组中的MYB基因表达模式分析,结果发现PtrMYB161基因在木质部特异表达,并且主要在纤维细胞中特异表达。为解析该基因在木质部发育中的表达调控功能,构建35S::PtrMYB161植物表达载体并进行毛果杨遗传转化,共获得6个PtrMYB161过表达转基因株系。RT-PCR结果表明,在过表达转基因株系中PtrMYB161基因的表达丰度增加500~5 000倍。表型和组织形态学分析表明,表达丰度增加最多的L5株系表现出明显的植株矮小、叶片面积小、茎节短、茎直径小、木质部面积减小及纤维细胞数量降低等特征,表明PtrMYB161基因参与调控毛果杨木质部发育等过程并起着至关重要的作用。     

超氧阴离子调节水稻幼苗不定根形成的分子机制

用DR5-GUS转基因水稻分析O_2~-·对水稻幼苗叶鞘节处不定根原基形成、生长素分布及生长素和细胞周期基因表达的影响。结果显示,DDC(SOD抑制剂)处理加快了水稻幼苗叶鞘节处不定根原基的形成、生长和生长素在不定根根尖的积累,相反,Tiron(O_2~-·清除剂)处理则延缓了这一过程。DDC、Tiron处理条件下,水稻幼苗叶鞘节处分别有15个生长素基因(如OsYUCCA5、OsPIN9、OsARF2和OsIAA17等)和13个细胞周期基因(如Oryza;CycD4;1、Oryza;CycT1;3、Oryza;CDKC;3和Oryza;CDKF;1等)的表达存在明显差异,揭示O_2~-·可能通过影响这些基因的表达而调控水稻不定根的形成和生长。结果说明,O_2~-·对水稻不定根形成的调节与其影响某些生长素和细胞周期基因的表达有密切关系。     

rolB-pttGA20ox双价基因在毛白杨中的表达及转化植株的形态特征

本研究对已整合外源rolB-pttGA20ox双价基因的毛白杨株系进行半定量RT-PCR检测,并对移栽后的转基因植株进行形态观测。结果表明:rolB和pttGA20ox基因的表达模式不同,rolB基因在不同器官中的表达强度为根>茎>叶,pttGA20ox基因的表达无组织特异性;rolB基因受外源生长素短时间诱导时表达丰度发生变化,pttGA20ox基因表达丰度不受外源生长素短时间诱导。对移栽温室后的转化植株的生长量分析结果表明,4个转化株系及对照的高生长增加量表现为RG-4>RG-1>RG-3>RG-2>CK。4个转化株系的株高和茎间长明显高于对照。转化株系与对照之间以及转化植株之间的形态特征出现了差异。     

新疆野苹果MsDREBA6提高植物抗旱性的作用初探

为探明脱水响应元件(DREBs)提高植物抗旱性的作用机制,以新疆野苹果(Malus sieversii Roem.)组培苗为试材,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MsDREBA6在干旱胁迫下的时空表达特性,并结合转基因拟南芥分析了过表达MsDREBA6对根系发育的影响。结果表明,MsDREBA6在新疆野苹果根系中表达水平最高,且受干旱诱导表达。过表达MsDREBA6拟南芥抗旱性显著增强,主根长度虽略短于野生型,但侧根密度和侧根长度均显著大于野生型;且转基因植株根系内源生长素(IAA)含量升高,玉米素核苷(ZR)含量略有降低,致使IAA/ZR显著提高。进一步分析表明,转基因拟南芥根系中参与侧根发育的生长素相关基因表达显著上调,而细胞分裂素生物合成受到抑制。由此推测,MsDREBA6可以通过调控一系列生长素和细胞分裂素相关基因表达变化,改变根系中IAA/ZR平衡,从而促进侧根发育以提高植物的抗旱性。     

根系修剪对枳生长及相关基因表达的影响

以枳实生苗为试验材料,通过两年重复试验分析了不切除主根、切除1/3主根、切除1/2主根、切除2/3主根等4个不同水平根系修剪处理下枳实生苗生长发育、根系构型和营养吸收的情况,并检测了不同水平根系修剪处理对侧根发育关键基因表达量的影响。结果表明,切除1/2主根处理增加了枳实生苗的株高、茎粗、地上部鲜重和根系鲜重,改善了根系构型参数(侧根数、总根长、根表面积和平均长度),增加了根系P、K、Ca、B、Fe、Na和Zn等营养元素含量。另外,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现,根系修剪处理诱导了侧根发育关键基因HOX1和CYP2的积累,并抑制了IAA11和IAA13的表达。综上所述,适度根系修剪可能通过诱导HOX1、CYP2基因的上调和IAA11、IAA13基因的下调来调控枳实生苗侧根的生长发育,改善根系构型,从而提高枳实生苗对营养元素的吸收能力及植株的生长发育。     

基于RNA-Seq的拟南芥不定芽再生过程的基因表达谱分析

[目的]本研究旨在分析拟南芥愈伤组织形成和不定芽再生2个阶段基因的差异表达情况,探究不定芽再生背后的相关基因调控机制。[方法]采用拟南芥不定芽再生两步培养法培养根外植体,利用RNA-Seq高通量测序技术分别对愈伤组织诱导培养基(CIM)培养0 d根外植体(C0)、CIM培养4 d根外植体(C4)、芽诱导培养基(SIM)培养3 d根外植体(S3)进行基因测序,利用软件分析基因表达情况。[结果]将C4的基因表达量和C0进行比对,共检测到4 332个差异表达基因,其中1 399个基因表达上调,2 933个基因表达下调;在不定芽再生阶段(S3与C4的基因表达量进行比对)检测到2 910个差异表达的基因,其中2 231个基因表达上调,679个基因表达下调。对差异表达基因进行转录物功能注释分析发现:明显富集的功能分类多与激素合成、代谢等生物过程有关。在愈伤组织形成阶段一些与细胞分裂素分解代谢相关的CKX基因和与生长素活性相关的GH3家族基因表达量明显增加,而与细胞分裂素合成相关的多个基因表达量却明显降低。在不定芽再生阶段与细胞分裂素合成相关基因表达量明显增加,CKX家族部分成员表达量则明显降低。同时,还发现多个转录因子基因表达量在不同阶段发生显著变化,比如AP2/EREBP家族的部分成员。[结论]对拟南芥不定芽再生过程基因表达谱进行检测和对比分析,获得了大量基因表达谱分析数据,为揭示不定芽再生过程的基因调控机制提供了有效的数据和理论依据。     

生长素酰胺水解酶基因在西瓜果实发育过程中的表达

生长素在植物果实发育与成熟过程中发挥重要作用,但生长素调控西瓜果实发育与成熟的分子机制尚不十分清楚。以含糖量低的野生西瓜PI296341-FR与含糖量高的栽培西瓜97103为试验材料,测定并比较了栽培与野生西瓜果实发育不同时期果实整组织游离态IAA的含量。结果表明:果实游离态IAA的含量随西瓜果实发育而上升,在授粉后18d达到峰值,后期逐步下降。含糖量高的栽培西瓜果实游离态IAA的含量在果实发育的各个阶段,均显著高于含糖量低的野生西瓜,说明果实游离态IAA的积累可能与果实成熟及含糖量积累相关。已有研究表明生长素酰胺水解酶(IAA-Leucine Resistant1-like Hydrolase,ILR1-like hydrolase,ILL)通过催化结合态生长素释放游离态生长素,是游离态生长素积累的限速酶。在西瓜全基因组上对ILL基因家族进行了系统进化树分析,通过qRT-PCR检测了西瓜各个组织的表达情况,发现西瓜果肉中只有4个ILL基因表达,并且栽培西瓜果肉中这4个基因的表达量均显著高于野生西瓜,其中,Cla017661在栽培西瓜果肉中的表达量最高,且与果实游离态IAA的含量变化趋势正相关,推测该基因对栽培西瓜游离态IAA的积累起关键作用,进而调控了西瓜果实的发育与成熟的进化。     

玉米脱落酸受体ZmPYL9基因的克隆及功能探究

脱落酸(ABA)参与植物发育过程以及调控多种非生物胁迫的适应性,PYL基因作为ABA受体,直接影响ABA的生物合成。为了探究玉米中PYL家族基因的功能,克隆了一个ZmPYL9基因,该基因编码197个氨基酸;物种同源蛋白质系统进化分析发现,ZmPYL9与高粱同源蛋白相似度甚高,且具有相同的保守基序;启动子顺式作用元件分析发现,ZmPYL9基因ATG上游2 000 bp区域含有多种激素应答相关的结合位点;ZmPYL9基因组织表达分析结果表明,该基因属于组成型表达,在胚乳中高度表达。ZmPYL9基因正向响应外源ABA诱导,恢复正常培养后,该基因表达量急速下降且低于CK;但是ZmPYL9基因受PEG和PEG+ABA负向诱导,且在PEG+ABA胁迫下该基因表达量高于PEG胁迫下,恢复正常培养后,2种胁迫下该基因的表达量均表现上升趋势。说明ZmPYL9基因响应干旱胁迫和ABA诱导,且ABA可以提高干旱胁迫下该基因的表达量。     

生长素极性运输PIN基因在拟南芥和荠菜不同组织的表达定量分析

为了解拟南芥和荠菜形态差异与其生长素极性分布的关系,采用荧光定量PCR,以–actin为内参基因,对拟南芥和荠菜的根、茎、叶、花等组织中与生长素极性运输相关的PIN1、PIN3、PIN7基因的表达进行定量分析。结果表明：拟南芥各组织中PIN1的表达量都高于荠菜各组织中PIN1的表达量,拟南芥的茎和花中PIN1的表达量分别比荠菜茎和花中PIN1表达量高3倍和10倍;拟南芥各组织中PIN7的表达量也高于荠菜各组织的PIN7表达量,其叶片中PIN7的表达量比荠菜叶片中PIN7的表达量高10倍以上;荠菜各组织中PIN3的表达都高于拟南芥相应组织中PIN3的表达量,在茎、叶中的表达分别高3倍和10倍以上,这些生长素极性运输蛋白相关基因表达的差异可能是导致2种植物形态差异的直接原因。     

植物生长素响应因子基因的研究进展

生长素响应因子(ARF)是一类调控生长素响应基因表达的转录因子,在生长素的信号传导过程中处于中心位置,它可与生长素响应元件特异结合,促进或抑制基因的表达.介绍了ARF结构特征,生物学功能以及调控机制.植物ARF由3个结构域组成:氨基端的DNA结合结构域(DBD),中间结构域(MR)以及羟基末端的二聚结构域(CTD).中间结构域包括激活结构域(AD)和抑制结构域(RD).在生长素信号转导过程中,ARF主要通过与生长素响应元件结合,促进早期基因转录,从而调节下游基因的表达.不同的ARF在不同的组织和器官中都有特异表达,同时通过ARF突变体的研究表明:不同的ARF具有各自独特的功能.这些功能特异性的产生,既可以来自在时间和空间表达上的不同,也可能是来自对目的基因启动子的亲和性差异.植物激素、外界环境因子和非编码区小RNA对ARF功能的发挥具有重要的调控作用.     

玉米ZmPGP1基因启动子的克隆及结构功能分析

为分析玉米ZmPGP1基因启动子的功能,利用巢式PCR方法克隆出了玉米ZmPGP1基因的启动子调控区,并将该启动子与GUS基因融合,通过基因枪法转入玉米(Zea mays)中,分析ZmPGP1启动子表达特性。结果显示,在玉米中克隆出ZmPGP1基因5′端上游1 090bp的启动子序列,该启动子序列包括光响应元件、激素响应元件和胁迫诱导及发育相关顺式作用元件。GUS染色表明ZmPGP1基因在玉米幼苗的茎部、叶子及根中都有表达,其中茎的节间处以及叶鞘部位表达量较高,这与ZmPGP1基因的Real-time PCR分析结果一致。研究结果进一步阐明ZmPGP1基因的功能以及作用机理。     

生长素促进拟南芥AtNRT1.1基因表达增强硝酸盐吸收

为研究生长素信号对植物硝酸盐营养吸收的调控作用,采用扫描离子选择电极技术 (SIET) 和实时荧光定量 PCR 技术(qRT-PCR),测定拟南芥野生型Col-0、生长素过表达突变体yuc1-D以及生长素通路缺失突变体axr1-12 3种株系初始根中硝酸根离子(NO-3)吸收速率以及硝酸盐转运蛋白基因AtNRT1.1表达量的差异,并进一步检测Col-0株系以及硝酸盐转运蛋白突变体nrt1.1株系在正常条件(CK)或施加外源IAA及生长素极性运输抑制剂2,3,5 三碘苯甲酸(TIBA)处理下的NO-3流速和AtNRT1.1基因表达量的差异。结果表明:yuc1 D株系的NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量相比野生型均有大幅增加,而axr1-12株系的 NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量相比野生型显著降低;在Col-0株系中施加外源IAA对NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量有明显促进作用,而施加TIBA的效果反之,说明生长素对硝酸盐吸收有增强效应。nrt1.1株系在CK、IAA、TIBA处理下NO-3吸收速率差异较野生型不明显,揭示了AtNRT1.1基因在生长素促进硝酸盐吸收途径中所起的重要作用。      

葡萄果实发育后期半定量RT-PCR内参基因的优选

葡萄果实发育后期基因表达水平的变化对果实品质形成具有重要影响,内参基因的选择是基因表达定量分析的关键影响因素.本试验以雷司令葡萄品种花后50、75和95 d的果实为材料,通过半定量RT-PCR,研究了常用持家基因Actin、Tubulin,GAPDH、18S rRNA的表达变化,探讨其作为葡萄果实发育后期基因表达半定量分析内参基因的可行性.结果表明:18S rRNA的表达水平高,且最稳定,其次是Actin,而Tubulin和GADPH的相对表达水平较低;对VvTLP、GHF17P和VvASR 3个功能基因在不同果实材料中的表达水平进行半定量RT-PCR,VvTLP和VVSR的相对表达水平较高,GHF17P的表达水平较低,整体上均呈现递增的趋势;以Actin和18S rRNA为内参得到的归一化结果基本一致,在4个持家基因中18S rRNA和Tubulin是优选的葡萄果实发育后期基因表达研究的内参基因.