利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物

将花榈木(Ormosia henryiPrain)基因组DNA用MseⅠ酶切后,连接相应的接头,PCR扩增后回收500~1000bp片段,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12,(AAG)8杂交后,运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。获得的序列经PCR扩增,连接载体pMD19-T,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用PCR法筛选文库,获得78个阳性克隆,经测序分析得到24个微卫星序列,成功设计出9对引物。     

鲢三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选及其特征分析

通过磁珠富集法筛选鲢(Hypophthalmichtys molitrix)的三、四核苷酸重复微卫星分子标记。提取鲢血液大片段基因组DNA,用限制性内切酶Sau3AI进行酶切,蔗糖密度梯度离心收集400~900 bp长度的片段,构建鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针(TGA)8、(CAG)8以及(AGAT)6进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pMD 18-T载体,转入感受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得微卫星文库;再用γ-32P标记的放射性同位素探针进行二次杂交筛选,获得1 758个阳性克隆,选择测序348个克隆序列中,共含有280个微卫星座位,其中完美型167个(59.64%),非完美型28个(10%),混合型85个(30.36%)。Primer 3.0软件设计60对引物,并用珠江水系的野生鲢群体对引物进行多态性位点检测。统计软件分析显示其中22对具有较高的筛选效率和多态性,可作为鲢种质评价等遗传分析的工具。研究亮点:首次利用多碱基(三、四核苷酸重复)探针筛选出微卫星分子标记结合同位素探针进行两次筛选...     

用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记

将磁珠富集法和用γ-32P标记的放射性探针法相结合,快速制备银鲫Carassius auratus gibelio微卫星。用限制性内切酶MboI对银鲫完整基因组DNA酶切,用不同蔗糖浓度梯度离心收集400~900 bp大小的片段,连接Brown接头,构建银鲫全基因组文库。用生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针进行筛选,磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列;对DNA模板进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌Escherichia coliDH5α中,得到微卫星序列文库;经用同位素γ-32P标记的探针(CA)16二次筛选,获得235个阳性克隆,对其测序,得224个含微卫星序列,完美型、非完美型、复合型序列分别占总数的52.8%、28.7%、18.5%。除探针中使用的(CA/GT)n重复单元外,还观察到(GA/CT)n、(ACTC)4的重复序列。设计163对引物,选择合成30对引物,经聚丙烯酰胺凝胶筛选,9对可以获得清晰条带,其中3对为单态,6对为多态。     

磁珠富集法分离柿微卫星标记

【目的】分离柿属植物的微卫星标记,为柿种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。【方法】提取磨盘柿(Diospyros kaki)基因组DNA后,用EcoRⅠ和MesⅠ2种内切酶酶切并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(GA)15和(AC)15探针杂交,杂交复合物用链亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段,经PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选阳性克隆,进行测序分析。【结果】测序96个克隆,54个含微卫星序列,24个为有效微卫星序列,其中完美型(perfect)9个,占37.5%;非完美型(imperfect)7个,占29.2%;混合型(compound)8个,占33.3%(。GA)n重复最为常见。21条含微卫星序列已登录GenBank(Accession Number:EF567396~EF567416)。成功设计21对引物,经初步筛选,14对表现出多态性。【结论】试验方法分离柿基因组微卫星简便有效,得到的多态性引物可用于柿种质资源的遗传研究。     

黄鳝微卫星标记筛选及其在不同性别表型群体中的遗传多态性

采用FIASCO(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats)法进行黄鳝微卫星标记筛选并将其应用于黄鳝性别差异群体的遗传变异分析.黄鳝基因组DNA经酶切、微卫星核心序列探针杂交、T载体连接并转化至DH5a中,构建黄鳝基因组微卫星富集文库.随机挑选75个阳性克隆测序,结果发现其中20个含有微卫星序列,利用软件成功设计了15对微卫星引物,经过黄鳝基因组DNA的PCR扩增及电泳检测,筛选8对多态性微卫星引物并对黄鳝3种不同性别表型群体的基因组DNA进行PCR扫描,结果显示:在8个微卫星座位中,共检测到51个等位基因,平均每个座位的等位基因数为6.375个,等位基因频率分布为0.001 2～0.603 3;黄鳝雌性表型群体、间性表型群体、雄性表型群体的平均遗传杂合度分别为0.637 1、0.696 9、0.734 5;平均多态信息含量分别为0.565 6、0.641 6、0.685 8,表明这些微卫星标记在黄鳝不同性别表型群体的遗传多态性发生了改变,它们可作为黄鳝遗传背景分析的分子标记.     

鲢三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选及其特征分析

通过磁珠富集法筛选鲢(Hypophthalmichtys molitrix)的三、四核苷酸重复微卫星分子标记。提取鲢血液大片段基因组DNA,用限制性内切酶Sau3AI进行酶切,蔗糖密度梯度离心收集400~900 bp长度的片段,构建鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针(TGA)₈、(CAG)₈以及(AGAT)₆进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pMD 18-T载体,转入感受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得微卫星文库;再用γ-³²P标记的放射性同位素探针进行二次杂交筛选,获得1 758个阳性克隆,选择测序348个克隆序列中,共含有280个微卫星座位,其中完美型167个(59.64%),非完美型28个(10%),混合型85个(30.36%)。Primer 3.0软件设计60对引物,并用珠江水系的野生鲢群体对引物进行多态性位点检测。统计软件分析显示其中22对具有较高的筛选效率和多态性,可作为鲢种质评价等遗传分析的工具。     

三角帆蚌微卫星的分离及遗传多样性分析

通过磁珠富集法筛选三角帆蚌微卫星标记并对其特征进行分析。用生物素标记的寡核苷酸探针(CA)16进行微卫星序列的富集,挑选96个阳性克隆测序获得77个含有微卫星的DNA序列,设计并合成了30对微卫星引物。以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)基因组DNA为模板,进行PCR扩增,结果筛选出11个多态性微卫星标记,1对引物等位基因数(NA)3~14,观察杂合度(HO)0.098~0.976,期望杂合度(He)0.336~0.917,多态信息含量(PIC)0.306~0.898,11个微卫星位点都偏离Hardy-Weinberg平衡,呈极显著差异(P0.01),说明洞庭湖养殖群体遗传多样性不高,遗传变异小,可能存在近交现象。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

[目的]研究合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选。[方法]采用生物素标记的5个探针,用磁珠富集法构建合浦珠母贝基因组微卫星富集文库,并对文库进行筛选、测序与引物多态性筛选。[结果]对500个克隆进行PCR筛选,测序分析发现130个克隆含有微卫星重复单元。序列比对后最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆,其中包含179个微卫星DNA结构域。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在合浦珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物,其中8对在种群中（n=32）具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0．239～0．787;等位基因数在2～9个;观测杂合度介于0．22～0．56;期望杂合度的变化范围为0．25～0．83。[结论]这研究为进一步开展合浦珠母贝的遗传分析提供了基础资料。     

梅花鹿微卫星DNA富集文库的构建与鉴定

梅花鹿基因组DNA经限制性内切酶MboI酶切,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳回收400～1000 bp的DNA片段,与MboI连接接头相连接,连接产物与生物素标记的(AC)15微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附,洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模版,以其中一个接头为引物进行PCR扩增,将扩增产物回收纯化并与pMD18-T载体相连接,转化大肠杆菌DH5a,构建梅花鹿(AC)n微卫星DNA富集文库,经测序分析表明该文库含重组克隆约为1 380个,其中计算得到阳性克隆率为82.9%。梅花鹿微卫星文库的建立将为一步进行梅花鹿基因组结构的分析、梅花鹿遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究、标记辅助选择以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。     

鲫鱼基因组DNA的扩增及在SSR分析中的验证

【目的】优化鲫鱼全基因组DNA扩增方法。【方法】使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。【结果】使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头后PCR扩增,获得扩增产物集中于250～1 500 bp。以扩增的滇池高背鲫鱼基因组DNA为模板,PCR扩增滇池高背鲫鱼的微卫星分子标记(SSR)位点,获得预期的扩增片段,电泳图谱与对照组(未扩增的基因组DNA为PCR模板)无差异。【结论】本研究优化了鲫鱼基因组DNA的扩增方法,并可用于SSR分析中,为鱼类大规模遗传分析提供了技术支撑。     

貉微卫星DNA富集文库的构建与鉴定

貉基因组DNA经限制性内切酶MboI酶切,用2.0%琼脂糖凝胶电泳回收200～800bp的DNA片段,与MboI连接头连接,连接产物与生素物标记的(AC)n微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pUCm-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,构建貉(AC)n微卫星DNA富集文库,经测序分析表明该文库含重组克隆约2800个,其中含有(AC)n微卫星DNA序列的阳性克隆占71.4%。     

三疣梭子蟹微卫星文库的构建及序列分析

采用磁珠富集法筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星序列。经Sau3AI酶切后的200~1000bp DNA纯化片段,与两端已知序列的人工接头连接,用含有生物素标记的(CA)₁₂和(GA)₁₂探针杂交,根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性,捕获含微卫星序列的单链DNA,以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,随后将获得的片段连接到PMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,成功构建了微卫星富集文库。测序其中的60个阳性克隆,得到42条微卫星序列(基因登录号为:HQ283153-HQ283194),除探针使用的CA/GT、GA/CT重复外,还得到GAGT重复序列。42条微卫星序列中,完美型31个(占73.8%),非完美型9个(占21.4%),混合型2个(占4.8%)。完美型的比例显著高于非完美型,这与其他真核生物微卫星序列的特征相一致。39条微卫星序列的重复次数大于10(占92.9%),其中,重复次数在10~19次之间的有27个,20次以上的有12个。筛选出的微卫星位点可为今后三疣梭子蟹遗传多样性评价、种群遗传结构鉴定及资源保护研究提供一套有用的分子标记。     

珠江三种亚科鱼类微卫星鉴别技术的建立

应用微卫星标记技术鉴别珠江3 种主要鲌亚科鱼类广东鲂（Megalobrama terminalis）尧鳊（Parabramis pekinensis）尧海南红鲌（Culter recurviceps）。从GenBank 和文献资料中初选3 种鲌亚科鱼类的微卫星标记、设计108 对微卫星引物、用PCR 扩增3 种鱼的基因组DNA、并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选出每种鱼的特异微卫星标记、共 获得16 个特异性标记。其中、微卫星标记F-524 在广东鲂和海南红鲌中扩增的目的片段为309~320 bp、在鳊中无扩 增条带;微卫星标记L-4 在鳊和海南红鲌中扩增目的片段为160~201 bp、在广东鲂中无扩增条带;微卫星标记L-7 在广东鲂和鳊中扩增的目的片段为160~190 bp、在海南红鲌中扩增的片段为123~143 bp。3 个微卫星标记、单独使用 1 个特异性标记或几种特异性微卫星标记相结合、可快速从分子水平鉴别出广东鲂尧鳊尧海南红鲌、从而解决3 种鲌 亚科鱼类早期发育过程中形态比较相似、通过形态鉴定比较困难的问题。     

藏马微卫星标记遗传多样性研究

为研究西藏藏马种群的微卫星多态性,应用生物素标记的微卫星探针与藏马基因组酶切片段杂交,通过链霉亲和素包被的磁珠捕获150～1 000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pEASY-T1载体中,构建藏马基因组微卫星富集文库。结果表明:从2 380个转化子中随机挑取112个阳性克隆进行测序后,经筛选比对发现,从62个微卫星中筛选出39个在马属基因组卫星库中未被检测到的微卫星;成功设计了10对藏马微卫星引物,经聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法检测到3个具有多态性的微卫星标记,其中有2个多态性信息含量(PIC)值均大于0.5。因此,这3个微卫星标记可应用于藏马遗传多态性检测、种群遗传结构等方面研究,为藏马遗传连锁图谱的构建、辅助育种、群体遗传学分析、基因组结构分析以及分子进化研究等提供依据。     

中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库.并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DHSα大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12:探针进行第二次筛选.结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5%;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8%.经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列.在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元.根据侧翼序列没计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,15对具有多态性.本研究对中华绒螯蟹基因组资源的开发利用提供了相关资料.     

亲和素磁珠分离毛竹SSR标记方法的优化

在参考其它文献报道的基础上,构建毛竹SSR位点富集文库。用EcoRⅠ分别和DraⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、PvuⅡ四种平端限制性内切酶对毛竹基因组DNA进行双酶切,酶切片段回收后与根据抑制性PCR原理设计的接头连接。在利用亲和素磁珠富集含有SSR序列的DNA片段过程中,对杂交、漂洗及洗脱步骤进行优化。通过三引物特异PCR筛选含有SSR序列的阳性克隆并结合测序结果对富集SSR文库进行评价,确定了一条简单、经济、高效分离竹类植物SSR标记的方法。     

大菱鲆微卫星标记的分离及其多态性位点检测

以生物素标记的（CA）12为探针进行杂交,借助磁珠筛选出含微卫星的Mbo I酶切片段,构建了大菱鲆Scophthalmus maximus微卫星富集文库,用同位素γ-^23P标记的探针（CA）12进行二次筛选,获得1600个阳性克隆,占59．3％。测序347个序列,得到335个（96．54％）含有微卫星序列的克隆,其中含有微卫星座位378个。完美型的微卫星序列有236个（62．4％）,非完美型的有121个（32．0％）,复合型的有21个（5．6％）,从所得序列中分离和鉴定了32对微卫星标记。利用31尾大菱鲆养殖个体评价微卫星位点,分析表明,10个位点具有多态性。不同位点等位基因数目为3～11不等,期望杂合度（He）和多态信息含量（PIC）变动范围分别为0．5061—0．8995和0．4133～0．8742。本研究中开发的微卫星多态性较高,将为大菱鲆养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等打下基础。     

鲮鱼微卫星标记的分离与鉴定

利用磁珠富集法构建了鲮鱼的(CA)n微卫星富集文库,所建文库共包含252个阳性克隆,从中随机选取60个进行测序,得到56个(93.3%)含有微卫星序列的克隆.其中,完美型微卫星49个(87.5%),非完美型微卫星2个(3.6%),复合完美型微卫星5个(8.9%).从所得序列中分离和鉴定了18对微卫星标记.采用20个鲮鱼养殖个体分析其多态性,发现其中12对为多态性标记,等位基因数变动范围为2～20,期望杂合度变动范围为0.261 5～0.950 0.本研究对以后鲮鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为鲮鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等打下基础.     

鲮鱼微卫星标记的分离与鉴定

利用磁珠富集法构建了鲮鱼的(CA)n微卫星富集文库,所建文库共包含252个阳性克隆,从中随机选取60个进行测序,得到56个(93.3%)含有微卫星序列的克隆.其中,完美型微卫星49个(87.5%),非完美型微卫星2个(3.6%),复合完美型微卫星5个(8.9%).从所得序列中分离和鉴定了18对微卫星标记.采用20个鲮鱼养殖个体分析其多态性,发现其中12对为多态性标记,等位基因数变动范围为2～20,期望杂合度变动范围为0.261 5～0.950 0.本研究对以后鲮鱼基因组资源的开发利用起到一定的促进作用,并为鲮鱼养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等打下基础.     

缢蛏微卫星多态性分析及其在亲子鉴定中的应用

利用磁珠富集法,构建了缢蛏(Sinonovacula constricta)微卫星富集文库。开发并筛选出18对微卫星引物,其中8对微卫星引物亲缘排除率较高,选取这8对引物对家系进行了亲子鉴定。结果表明,18对微卫星引物在12个个体中等位基因为2~6,平均等位基因为3.00;观测杂合度在0~1.000之间,平均值为0.581 3;期望杂合度0.290~0.779,平均值为0.528 4;多态信息含量为0.239~0.703,平均值为0.432 2。当两个亲本基因型未知时,8对微卫星引物在整个家系中单个亲本排除率(E-1P)为0.583~0.916,平均值为0.790 0;当一个亲本基因型已知时,另一个亲本的排除率(E-2P)为0.406~0.830,平均值为0.653 9。同时可知在子代个体数量不断增加的情况下,排除率仍在较高范围,因此可以作为亲子鉴定的分子标记。这对于缢蛏规范化养殖、家系选育的开展具有重要意义。