梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

  目的  低温是影响梅花Prunus mume栽培应用的重要环境因素。WRKY基因是一类主要存在于植物中的转录因子，参与响应非生物胁迫等过程。了解梅花WRKY基因对非生物和脱落酸(ABA)胁迫的响应，对梅花定向育种具有重要的意义。  方法  以梅花‘骨红朱砂’Prunus mume ‘Guhong Zhusha’为材料，通过反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了2个WRKY2转录因子，命名为PmWRKY2-1和PmWRKY2-2；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因在低温和干旱下的表达模式。  结果  PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的编码区长度分别为2 223和2 220 bp，分别编码740和739个氨基酸，包含2个WRKY结构域和C₂H₂型锌指结构；PmWRKY2-1与PmWRKY2-2亲缘关系较远，但两者与蔷薇科Rosaceae植物欧洲甜樱桃P. avium、桃P. persica、李P. dulcis的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:在低温和干旱处理下，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2都能被诱导；脱落酸(ABA)处理后，PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的表达显著降低。  结论  PmWRKY2-1与PmWRKY2-2可能参与调控梅花低温和干旱响应，并可能受到ABA的调控。图6表1参28     

梅花PmERF4基因的克隆及其表达分析

为阐明梅花(Prunus mume)ERF基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’中克隆获得1个PmERF4基因。生物信息学分析表明该基因cDNA全长序列为842 bp,完整开放阅读框(ORF)为690 bp,编码229个氨基酸。氨基酸序列比对发现,PmERF4蛋白包含1个AP2/ERF保守结构域。系统进化分析结果显示,梅花PmERF4蛋白与李亚科李属植物的ERF蛋白高度同源。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PmERF4基因在非生物胁迫和激素处理下的表达,结果表明:PmERF4基因受低温、氧化胁迫的诱导,但响应程度不同,它能够持续且强烈地响应低温胁迫,对甘露醇、MeJA、SA处理不敏感,而高盐和ABA则抑制其表达;PmERF4基因可能在梅花低温胁迫应答中发挥重要作用。     

甜樱桃砧木PcWRKY71基因克隆及表达分析

为研究甜樱桃砧木WRKY71转录因子的功能及其对非生物胁迫和激素处理的响应,本研究克隆了甜樱桃砧木‘Gisela 6’的PcWRKY71基因序列,序列分析表明PcWRKY71完整开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,含有1个WRKY保守结构域和1个C₂H₂锌指结构域,属于WRKY基因家族第Ⅱ类成员。生物信息学分析推测PcWRKY71编码蛋白分子量为37.41 kDa,理论等电点为6.72,属于不稳定的亲水性蛋白,定位于细胞核上,与甜樱桃和樱花的亲缘关系最近。荧光定量分析结果表明,PcWRKY71基因表达受干旱、盐害和低温胁迫诱导及激素SA和MeJA影响,说明PcWRKY71转录因子对甜樱桃砧木应答非生物胁迫和激素处理起着重要作用。     

不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。     

柑橘胁迫响应基因WRKY47的克隆与表达分析

以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]、芦柑(Citrus reticulata Blanco)、金柑[Fortunella japonica(Thunb.)Swingle]为试验材料,基于甜橙基因组数据库中的甜橙基因碱基序列,利用RT-PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的cDNA全长碱基序列.序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长都是1567 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸.氨基酸序列和结构分析结果显示,这4个基因编码的蛋白质属于Group IIa+IIb类WRKY蛋白.进化树分析结果显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与克莱门柚WRKY47蛋白的亲缘关系最近.对CsWRKY47启动子顺式作用元件预测分析,发现CsWRKY47启动子包含脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motiF)、抗氧化响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等多个与胁迫相关的顺式作用元件.实时荧光定量表达分析结果表明,柠檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47能被高盐、干旱、低温胁迫诱导表达;芦柑CrWRKY47在干旱和低温胁迫下诱导表达,高盐胁迫下表达量下调;金柑FjWRKY47在高盐胁迫下诱导表达,干旱和低温胁迫下下调表达.为进一步开展柑橘胁迫相关基因WRKY47的功能鉴定奠定了基础.     

苹果MdWRKY18和MdWRKY40参与盐胁迫途径分子机理研究

【目的】研究苹果WRKY转录因子MdWRKY18和MdWRKY40蛋白结构、表达水平及在盐胁迫中的功能,为进一步完善盐胁迫分子机理的研究提供参考。【方法】以‘红脆2号’苹果为试材,克隆MdWRKY18和MdWRKY40,对其蛋白结构进行分析;采用qRT-PCR测定该基因在盐胁迫条件下的表达水平,并通过GUS染色分析它们启动子活性,利用酵母双杂分析其互作关系,并通过转基因验证其功能。【结果】蛋白结构分析表明MdWRKY18和MdWRKY40均含有一个WRKY、Cx5C以及HxH结构域;MdWRKY18和MdWRKY40表达水平和启动子活性受150 mmol·L-1NaCl诱导,酵母双杂交试验表明,MdWRKY18和MdWRKY40能够和自身互作形成同源二聚体,且MdWRKY18也能和MdWRKY40互作形成异源二聚体;在‘王林’愈伤中分别过表达MdWRKY18和MdWRKY40时,能够促进MdSOS1和MdNHX1的表达,并提高‘王林’愈伤在盐胁迫处理下的生长量,在‘王林’愈伤中共表达MdWRKY18和MdWRKY40时,同样能够促进MdSOS1和MdNHX1的表达,但对提高‘王林’愈伤的生长量要高于分别过表达MdWRKY18和MdWRKY40。【结论】苹果MdWRKY18和MdWRKY40受盐胁迫的诱导,可以形成同源或异源二聚体,并增强‘王林’愈伤对盐胁迫的耐性。     

低温胁迫下油棕WRKY转录因子基因的表达特性分析

[目的]研究低温胁迫下WRKY转录因子基因表达特性,并分析其与油棕抗寒性的相关性,为阐明WRKY转录因子在油棕生长和低温响应机制中的功能和作用提供理论参考.[方法]以油棕品种XJS30和SJ64为材料,对其进行低温驯化处理(0h、1d和7d)及冷处理(10℃4h、8℃4h、6℃4h、4℃4h和2℃4h),利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同处理时间的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因表达特性,并分析其与油棕抗寒性的相关性.[结果]WRKY1和WRKY7基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时高,说明其在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用.WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均在XJS30冷处理中表达量最高,说明其在冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用.WRKY1基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时低,说明其在冷处理过程中对SJ64的抗寒性发挥调控作用.WRKY7基因在低温驯化结束时的相对表达量较冷处理结束时高,说明其在低温驯化过程中对SJ64的抗寒性构成发挥调控作用.[结论]油棕的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均属于低温应激反应型基因.     

柑橘抗逆基因WRKY75的克隆与表达分析

[目的]低温、干旱、高盐等非生物胁迫严重限制柑橘的生长发育和地理分布.转录因子可以调控下游抗逆基因表达,在植物响应非生物胁迫的过程中起了重要的作用.WRKY是植物中重要的转录因子家族之一,其家族成员在植物抗逆过程中起着重要的作用.为研究WRKY转录因子在柑橘抗逆中的功能.[方法]以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck.]、金柑[Fortunella margarita(Lour.)Swingle.]和芦柑[Citrus reticulata Blanco.]等柑橘品种的实生苗为试验材料,通过电子克隆和RT-PCR的方法从4种材料中克隆到4个新的WRKY家族基因,分别命名为ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75、CrWRKY75,并对其进行生物信息学和不同组织及胁迫处理下的表达模式分析.[结果]生物信息学分析结果显示ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75的cDNA序列全长分别为702,702,705,705 bp,分别含有582,582,585,585 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),分别编码193,193,194,194个氨基酸;推测其蛋白分子质量分别为21.73、21.67、21.80和21.80 ku,等电点分别是9.33、9.25、9.25和9.25,且均含有WRKY家族的保守结构域(1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构域).多序列比对发现,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白与克莱门柚CcWRKY75、苹果MdWRKY75、可可TcWRKY75和葡萄VvWRKY75同源性高于90％.系统进化树分析结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和Cr WRKY75与克莱门柚CcWRKY75的亲缘关系最近,与烟草NtWRKY75的亲缘关系较远.亚细胞定位预测结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白均定位于细胞核.蛋白二级结构预测结果显示,4种WRKY75蛋白含无规则卷曲结构39.18％～52.33％,α-螺旋结构29.02％～35.05％,延伸链结构10.36％～13.92％,β-转角结构8.29％～11.86％.实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)分析显示,4℃低温处理能提高4个柑橘WRKY75基因表达.而20％PEG6000模拟干旱处理只能提高FmWRKY75和CrWRKY75表达量.250 mmol/L NaCl胁迫处理只能提高CsWRKY75和FmWRKY75表达量.[结论]结果表明柠檬ClWRKY75、甜橙CsWRKY75、金桔FmWRKY75和芦柑CrWRKY75是WRKY基因家族的成员,且受多种非生物胁迫诱导表达,推测其可能在柑橘响应非生物胁迫过程中发挥了重要作用,该研究结果为进一步研究柑橘抗逆的分子机制提供理论参考.     

玉米ZmWRKY41基因克隆及转录激活验证

[目的]干旱是影响作物生长发育及产量的重要因素。植物WRKY转录因子超家族在植物的生长发育、响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。因此,克隆分析玉米WRKY转录因子的序列特征和功能,为研究玉米耐逆分子育种提供重要抗逆基因资源。[方法]本研究以玉米自交系B73为材料提取玉米总RNA反转录cDNA,克隆、分离获得ZmWRKY41基因编码区全长序列。DNAMAN比对发现,ZmWRKY41蛋白具有保守结构域WRKYGQK和锌指结构域(zinc-finger motif)C2HC,属于第三类WRKY转录因子家族。利用生物信息学方法研究该基因蛋白质理化性质,并对其进行结构分析预测。利用PlantCARE在线工具预测、鉴定ZmWRKY41基因启动子区是否含有响应非生物胁迫的顺式作用元件。将ZmWRKY41基因编码区全长序列构建pGBKT7诱饵载体上,与GAL4DNA结合域融合,转化酵母菌株AH109验证ZmWRKY41转录因子转录激活活性。[结果]玉米ZmWRKY41基因编码区全长774bp,含有长度分别为221bp、126bp、427bp 3个外显子,共编码257个氨基酸序列。蛋白质高级结构预测发现,ZmWRKY41蛋白包含2个α-螺旋结构和5个β-折叠结构,不含跨膜结构和信号肽。ZmWRKY41基因启动子元件预测发现,该启动子中含有干旱胁迫(CGGTCA)、热胁迫(AAAAAATTTC)、低温胁迫(CCGAAA)等非生物逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。酵母转录激活验证实验显示,将含有pGBKT7-ZmWRKY41融合表达载体转化酵母AH109菌株,能在单缺、三缺培养基正常生长且能使α-半乳糖苷酶底物分解显蓝色,表明ZmWRKY41基因具有转录激活活性。[结论]玉米ZmWRKY41基因是WRKY转录因子基因家族成员之一,在酵母体内具有转录激活活性,可能参与响应非生物逆境胁迫,为进一步研究该转录因子调控非生物逆境胁迫奠定基础。     

烟草WRKY8基因的克隆与表达分析

利用数据库资源和RT–PCR技术获得烟草WRKY8基因,序列分析表明,该基因包含1 551 bp的开放阅读框,编码516个氨基酸。基因编码的蛋白含有2个WRKY结构域,其锌指结构类型为C2H2(C–X4–5–C–X22–23–H–X1–H)。推测其可能定位于细胞核并具有复制转录及调控的功能,从而参与对植物生长发育和胁迫应答的调节。RT–PCR结果表明,NtWRKY8基因受低温诱导表达。     

植物miRNA抗逆性研究进展

在逆境胁迫下,植物中的miRNA能够迅速表达并作用于某些与逆境相关的基因,启动植物的某些抗逆信号系统,提高植物抵御不良环境危害的能力。文章就miRNA的合成、作用机制、进化特点及其在植物对高盐和干旱等胁迫中的抗逆作用机制进行了综述,并对植物miRNA的研究发展趋势进行了展望。     

水稻LEA_2家族的鉴定与表达谱分析

为探索水稻LEA_2家族成员的特点,通过生物信息学分析从水稻基因组中鉴定出60个LEA_2家族成员,它们不均匀分布于12条染色体。蛋白序列分析结果显示,LEA_2家族蛋白的分子质量为16.24～49.14 ku,等电点4.7～11.7,有42个蛋白倾向于疏水;系统进化树分析显示,LEA_2家族可以分成5个组,同一组的蛋白成员包含的保守基序类型基本相同;基因结构分析表明LEA_2基因包含少量的内含子或者不含内含子;启动子分析表明水稻LEA_2基因启动子包含大量与逆境胁迫响应、激素信号传导及生长发育有关的作用元件。根据表达谱分层聚类分析及荧光定量PCR实验发现水稻LEA_2家族基因间共表达现象明显,同时发现OsLEA2-2和OsLEA2-26基因均受干旱胁迫上调表达60倍以上。     

逆境胁迫下硅的抗性作用机理研究

硅是对植物生长有益的一种营养元素,能提高作物的产量,改善作物品质。硅还可以提高植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力。综述了国内外有关硅在缓解病虫害、干旱、盐害、重金属毒害及冻害等逆境胁迫下的作用及机理方面的研究。     

硅对植物抗逆性影响的研究进展

硅作为有益元素,具有促进植物生长、提高作物产量的作用,同时硅在增强植物抗逆性方面也发挥着重要作用。为进一步探究硅增强植物抗逆性的深层作用机制,本文综述了硅增强植物抵御生物胁迫（包括病原菌、害虫等）及非生物胁迫（干旱、盐害、重金属等）方面的研究进展,认为硅可通过改善植物形态、平衡养分吸收、调节激素代谢、改良土壤性状等多种作用机制缓解胁迫。针对硅的未来研究方向进行了展望,如硅抵抗各种胁迫的耦合机制,深入研究硅提高植物抗逆性的生物化学及分子机制以及加强新型硅肥及配套施用技术的研发。     

Advanced Progress on Adaptive Stress Response of Oenococcus oeni

Oenoccoccus oeni is an alcohol-tolerant, acidophilic lactic acid bacterium with its ability to perform malolactic fermentation in wine, which is of fundamental importance in oenology. As a representative of the wine bacterium with remarkable adaptability to the very harsh physicochemical conditions of wine, many studies were carried out for its applied interest and focused mainly on its stress response mechanisms of O. oeni. on both physiological and molecular levels. In this review, three main stress response mechanisms in O. oeni during culturing process were addressed. Of them, various solute transporters and secondary metabolic energy-generating systems were utilized to control the intracellular environment and the energetic status of O. oeni. The changes in cell membrane fatty acid composition profiles and synthesis of stress proteins, especially small heat shock proteins were required for active cell response to maintain membrane integrity and function under stress conditions. The study on stress response of O. oeni played an important role on culture bacteria selection, making inoculation culture and construction of other engineering bacteria.     

胁迫萌发与不同水分胁迫强度下水稻对供氮形态的响应

采用营养液培养及聚乙二醇(PEG6000)模拟水分胁迫的方法,比较了3种供氮形态(NO3--N、NH4+-N和NO3--N与NH4+-N等体积混合)、3种水分条件(非水分胁迫、50 mg.L-1和100 mg.L-1PEG胁迫)和3种种子萌发方式(正常萌发、50 mg.L-1和100 mg.L-1PEG萌发)对水稻由苗期至分蘖期生长的响应。结果表明:在2种强度的水分胁迫条件下,3种供氮形态处理中始终以NH4+-N营养条件下水稻的生物量最高;在水分胁迫条件下,除NH4+-N外,其余2种供氮形态中水稻(包括正常萌发和胁迫萌发)光合同化物均被相对优先分配至根系;此外,胁迫萌发较正常萌发相比,不仅提高3种供氮形态下苗期至分蘖期水稻的生物量,而且还提高了水分胁迫条件下NH4+-N营养条件下水稻对氮、磷的利用率。     

植物响应环境胁迫过程中的蛋白质组变化规律研究进展

植物在生长过程中可能会受到来自环境的多种胁迫,包括以高温、低温、干旱、水涝、高盐、臭氧、光照、矿物质、酸雨、辐射、重金属和机械损伤为代表的非生物因素环境胁迫和以诱导子、细菌、真菌、病毒和植食性动物为代表的生物因素环境胁迫。植物通过改变自身的蛋白质表达水平来对各种环境胁迫作出响应,因此蛋白质组学技术方法能够更好地揭示植物耐受胁迫相关的重要蛋白质群组的动态变化规律,发现植物响应环境胁迫的重要标志物。对近年来植物应答环境胁迫的蛋白质组学研究进行综述,以期从组学角度拓展植物耐受胁迫机制的认识。     

氯化钠和碳酸钠对芦笋的胁迫效应比较

对一年生芦笋幼苗用0、0.1、0.2、0.3mol/L的中性盐NaCl和碱性盐Na2CO3处理,检测芦笋对盐碱的耐受程度。结果表明:在两种盐胁迫下MDA含量、叶绿素含量及质膜透性的变化趋势基本相似,但碱性盐Na2CO3胁迫使MDA含量急剧上升,质膜透性也明显增加,叶绿素含量下降显著,表明碱性盐Na2CO3对芦笋破坏较中性盐NaCl严重。两种盐对渗透调节物质含量的影响上表现为碱性盐Na2CO3处理使脯氨酸、可溶性蛋白含量增加显著,中性盐NaCl处理使可溶性糖含量增加明显,说明芦笋可通过增加渗透调节物质含量提高对盐碱的抵抗能力。     

大体积混凝土温度应力计算中的应力修匀

利用精度较高的高斯积分点的应力值来改进等参元结点应力的性质,采用数学方法计算出了相应的高斯点坐标和形函数值,推导了三维8节点等参元和20节点等参元的应力修匀平滑矩阵,并求出了数值解。     

图书馆员工作压力及其应对策略

分析了图书馆员工作压力的外在表现及其对工作的影响,剖析了工作压力的成因,提出了要从图书馆和馆员两个方面缓解工作压力,减少工作压力的危害,提高馆员工作的主动性、能动性和创新性。