水稻半胱氨酸蛋白酶OsCP2的特征分析及其原核表达与纯化

半胱氨酸蛋白酶是植物体中重要的蛋白水解酶,广泛参与种子萌发、幼苗发育、胁迫响应和组织分化衰老等生理过程.我们对水稻中半胱氨酸蛋白酶基因OsCF2 (Oryza sativa cysteine protease 2)序列进行分析.该基因cDNA全长2 279 bp,由2个外显子和1个内含子组成;包含1个1 089 bp的开放读码框,编码1个含362个氨基酸残基的蛋白,在蛋白氨基端有-36个氨基酸组成的信号肽.生物信息学分析表明,OsCP2与大麦半胱氨酸蛋白酶HvCP同源性最高,同属木瓜蛋白酶亚家族.另外,我们构建了pET32a/CP2原核.表达载体,通过转化大肠杆菌BL21DE3,成功表达了OsCP2重组蛋白.分子量约为58kD;通过纯化包涵体获得了纯度高达90%以上的重组OsCP2蛋白,这为进一步研究该基因的功能提供了基础.     

大豆GmHAT5的克隆及其转基因百脉根的抗盐分析

【目的】从大豆盐胁迫基因表达谱中筛选并克隆得到同源异型域亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip)家族基因GmHAT5,将其转化豆科模式植物百脉根并进一步探究其抗盐调控机制。【方法】使用多种生物信息学软件对GmHAT5的开放读码框(ORF)、编码蛋白的分子量、等电点、序列结构和蛋白定位等进行预测,同时将大豆GmHAT5蛋白与其他10个物种的同源蛋白进行比对分析,并对GmHAT5在大豆不同器官及盐胁迫下的表达特性进行分析。此外,构建GmHAT5的植物超表达载体,通过对发根农杆菌LBA1334的转化,得到"复合体"百脉根植株,并在盐胁迫条件下对其进行抗盐表型分析;通过对根癌农杆菌EHA105的转化,获得百脉根的稳定转化株系,并对其进行抗盐表型分析及相关生理指标检测。【结果】多种生物信息学软件分析表明,该片段包含1个1 038 bp的ORF,编码345个氨基酸。GmHAT5的理论分子量和等电点分别为39.17 k D和4.63。GmHAT5蛋白定位于细胞核,与其他HD-Zip家族蛋白一样,属于典型的核蛋白。序列分析表明,GmHAT5包含一个同源异型结构域和一个亮氨酸拉链结构域,属于第I类同源异型域亮氨酸拉链蛋白。同源蛋白比对表明其与野生大豆GsHAT5同源性最高。基因表达特性分析表明,GmHAT5在大豆植株的各个不同器官中均有表达,是一个受盐诱导上调表达的HD-Zip类转录因子。发状根转化的结果表明,使用200 mmol·L~(-1) NaCl处理植株7 d后,"复合体"植株生长状态良好,对照组植株叶片明显萎蔫、失绿;不同NaCl浓度处理离体转基因发状根14 d后,对照组较试验组发状根明显干枯、生长受到抑制。稳定转化结果显示,不同盐浓度处理14 d后,转GmHAT5百脉根与两组对照植株相比生长状态更好。相关生理指标检测结果显示,与两组对照相比,转基因百脉根植株中丙二醛含量和相对质膜透性明显降低(P0.05),而叶绿素含量和根系活力则显著升高(P0.05)。测定不同植株阳离子含量的结果表明,转基因百脉根株系与两组对照相比,Na~+在叶片和根中含量显著下降,K~+和Ca~(2+)在叶片和根中含量显著升高。【结论】从大豆中克隆得到一个编码HD-ZipⅠ类同源异型域亮氨酸拉链蛋白基因GmHAT5,该基因在大豆中受盐胁迫诱导表达量显著升高。超量表达GmHAT5显著增强百脉根的耐盐能力,发状根转化法可以作为一种快速有效筛选抗盐候选基因的手段。推测GmHAT5在大豆盐胁迫应激调控中扮演重要角色。     

百脉根Rboh基因家族在共生固氮中的功能研究

为探索植物呼吸爆发氧化酶（respiratory burst oxidase homologue,Rboh）基因家族在共生固氮中的功能和作用机制，利用分子生物学、细胞生物学和遗传学等方法，围绕百脉根Rboh基因家族中在根瘤中特异性表达的基因LjRbohA（Lj5g3v1497840）以及在根瘤中高表达的基因LjRbohB（Lj6g3v1549190）和LjRbohC（Lj5g3v1497820），分别对其蛋白的亚细胞定位、基因的表达模式、基因的启动子活性及蛋白的功能进行了研究。结果显示：LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC蛋白都定位在植物的细胞膜上；LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC基因在接种根瘤菌后表达上调；LjRobhA和LjRobhB基因在根瘤、维管束和侧根原基表达；利用CRISPR Cas9技术对LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC 3个基因分别进行敲除导致结瘤数目减少。这些研究结果表明，LjRbohA、LjRbohB和LjRbohC这 3个基因可能都参与调控百脉根与根瘤菌的共生结瘤过程。     

拟南芥和水稻cystatin基因家族的生物信息学分析

利用已经分离的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的cystatin结构域为检索序列在基因组水平上对拟南芥和水稻中的cystatin基因家族的成员进行分析;同时利用这些基因编码的蛋白质序列构建系统发生树,并对这些蛋白序列的保守序列进行分析;最后在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列。结果表明:1结合结构域的鉴定、多序列联配以及MEME分析最终确定了7个拟南芥和11个水稻的cystatin基因。2系统发生分析表明,cystatin基因的基本特征很可能是在拟南芥和水稻的分离之前就已经形成。3 cystatin结构域在蛋白质间高度保守。4拟南芥和水稻的cystatin基因主要在花、叶、根、种子和愈伤组织中表达,这有助于植物避免昆虫的侵害。     

利用EMS筛选豆科模式植物百脉根的根瘤突变体及突变部位

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,被根瘤菌感染后形成根瘤,根瘤菌固定氮素变换成铵态氮,植物利用铵态氮进行营养生长,而根瘤菌利用植物供给的碳酸同化产物为能源。为获得根瘤的成熟、维持的基因,本研究利用化学诱变试剂EMS处理百脉根MG-20得到多种突变体,筛选根瘤成熟、维持有异常的突变植株,利用SSR标记和dCAPS标记进行基因定位。结果表明:约10万M2百脉根植株中获得nup85突变体2株,nup133突变体4株,pollux突变体6株,ccamk、symrk、castor、nin、nfr1、nfr5突变体各1株等不结瘤突变体(Nod~-)18株;结无效根瘤突变体(Fix~-)6株并确定了突变体的突变部位。     

毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表达及蛋白纯化

【目的】对毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4进行原核表达及重组蛋白纯化,为进一步研究该基因的酶学特征和生理功能打下基础。【方法】从毛果杨中克隆两个半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4,构建其原核表达载体p ET-30a-Pt CP_2及p ET-30a-Pt CP4,并在转入大肠杆菌后在体外诱导表达重组蛋白,采用包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。【结果】Pt CP_2基因CDS序列全长1107 bp,编码368个氨基酸;Pt CP4基因CDS序列全长1104 bp,编码367个氨基酸。Pt CP_2和Pt CP4基因编码的蛋白均属于RD19A-like类型木瓜蛋白酶。Pt CP_2和Pt CP4基因在毛果杨根、茎、叶中均有表达,其中Pt CP_2在叶中表达量最高,Pt CP4在根中表达量最高。通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4,切除信号肽后蛋白酶大小分别为38.151和38.069 k D。【结论】原核表达获得的纯化重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4可用于进一步研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶的酶学特征和生理功能。     

百脉根中Lj5NG4与结瘤因子受体LjNFR1互作调控根瘤菌侵染

以百脉根结瘤因子受体激酶LjNFR1为诱饵,通过建立百脉根根瘤共生不同时期的酵母膜双杂文库筛选获得了一个与之互作的生长素相关转运蛋白Lj5NG4。通过酵母双杂交和烟草Split-Luc等试验进一步证实了Lj5NG4与LjNFR1的蛋白互作。利用CRISPR-Cas9基因敲除及超表达技术创建相关转基因材料,研究发现Lj5NG4可能在根瘤菌侵染前期起负调控作用,但对结瘤过程没有显著影响。同时启动子表达也证实了Lj5NG4在侵染前期根毛中强烈表达,成熟根瘤内部不表达。外源施加生长素试验发现低浓度的生长素会减弱Lj5NG4突变体的早期侵染表型,这表明生长素在共生结瘤发育中通过Lj5NG4发挥功能。     

橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因HbCP3的克隆与表达特性分析

半胱氨酸蛋白酶是一类重要蛋白水解酶,其广泛参与植物的生长发育及各种生物与非生物胁迫的应答。根据EST序列信息设计引物,从橡胶树的根中分离到1条1 056 bp的c DNA。该序列包含1个1 023 bp的开放阅读框(ORF),13 bp的5'UTR和20 bp的3'UTR。ORF预测编码340个氨基酸,相对分子质量为37 350,等电点为5.24,属于液泡定位的分泌型蛋白。该蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,可归为木瓜蛋白酶C1家族。该蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和杨树(Populus trichocarpa)中同源蛋白的相似性都在80%以上,将基因命名为Hb CP3。表达分析显示,在橡胶树的根、树皮、木质部、芽、叶片、叶柄和乳管等组织中,基因仅在根中表达。     

百脉根泛素结合酶LjE2的表达及活性鉴定

为了研究泛素化作用在豆科植物共生固氮过程中的调控功能和作用机制,利用拟南芥泛素结合酶E2的序列,在百脉根基因组上鉴定得到14个编码E2(LjE2)的基因,从LjE2中克隆到11个基因并构建了融合表达载体pET-LjE2s:His。通过大肠杆菌表达系统,表达并纯化到10个LjE2:His融合蛋白。经体外泛素化及Western blot分析,在10个LjE2中有9个具有泛素结合酶活性,1个(LjE2-5)未检测到泛素结合酶活性。     

日本百脉根γ-生育酚甲基转移酶基因的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法,以拟南芥-γ生育酚甲基转移酶cDNA序列为信息探针,在GenBank的HTGs数据库中找到与之高度同源的日本百脉根基因组DNA序列——LjT44D21克隆。通过GENSCAN分析及序列拼接得到日本百脉根"γTMT基因的cDNA序列,GenBank的登陆号为DQ013360。用该序列对GenBank中的est-others进行相似性搜索,获得了44条日本百脉根的EST序列,经拼接后发现与基因组预测的基因序列一致,表明该基因是真实存在和表达的。该cDNA序列长为1 077 bp,具有完整的开放阅读框架(1～1 077 bp)。推测编码蛋白为358个氨基酸,该蛋白序列与大豆、水稻、小麦、拟南芥、油菜、苜蓿和衣藻等物种的-γTMT蛋白质序列进行了同源性比较分析,具有很高的同源性。