斑蝥素对昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9的作用效果

以昆虫细胞Spex-Ⅶ和Sf9为试材研究斑蝥素对昆虫的杀虫机理。采用MTT法,结果表明,斑蝥素对这两种细胞凋亡的增殖有剂量和时间依赖性抑制作用,且对Sf9作用更为敏感:处理2,3,4 d后,斑蝥素对Spex-Ⅶ细胞的抑制中浓度(IC50)分别为17.623 8,13.225 1,10.707 8μg/mL;对Sf9细胞的IC50为5.433 8,1.228 9,1.222 6μg/mL;采用瑞氏-吉姆萨细胞染色和Hoechst33258荧光细胞染色法,结果表明12.5μg/mL斑蝥素处理Sf9细胞,25μg/mL和50μg/mL斑蝥素处理Spex-Ⅶ细胞,2 d后,斑蝥素对两种细胞有诱导凋亡的作用。可以观察到凋亡形态特征:胞膜完整,染色质固缩,核碎裂,凋亡小体形成。     

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15～1.50 μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35～3.50 μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24～48 h,喜树碱0.35～3.50 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1～10.0 μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)以0.048～4.800 μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.     

骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾离体细胞系和幼虫血细胞的毒性作用

【目的】研究骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾幼虫的杀虫作用机理,为此类生物碱作为新型植物杀虫剂的开发应用提供理论依据。【方法】从骆驼蓬成熟种子中提取骆驼蓬总碱,采用MTT法测定0,1,5,10和20μg/mL骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系(Sf9)的毒性;测定5μg/mL骆驼蓬总碱在处理10,30,50,70和90min时对Sf9细胞Na~+和K~+吸收的影响,并测定5μg/mL骆驼蓬总碱在处理1,2,3,4,5d后对葡萄糖吸收的影响;最后采用叶碟法(叶碟在20μg/mL骆驼蓬总碱中浸3s)和注射法(2μg/头)分别测定处理1,8,16,24和48h时骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾4龄幼虫血细胞数量的影响。【结果】10和20μg/mL骆驼蓬总碱处理草地贪夜蛾Sf9细胞24h后,对细胞的抑制率分别为62.04%和83.25%;骆驼蓬总碱处理后8,16,24和48h,其对草地贪夜蛾Sf9细胞的LC50分别为35.32,23.21,14.87和8.98μg/mL,骆驼蓬总碱对Sf9细胞的毒性有时间滞后效应。5μg/mL骆驼蓬总碱处理Sf9细胞后10min,Sf9细胞对Na~+、K~+的吸收速率明显增加,处理后30min Sf9细胞对Na~+、K~+的吸收逐渐减弱;处理后3dSf9细胞对葡萄糖的吸收迅速增加,处理后4dSf9细胞对葡萄糖的吸收趋于停止。以叶碟法和注射法处理草地贪夜蛾4龄幼虫,8h后幼虫血细胞数量显著降低,但随时间延长幼虫血细胞数量又逐渐增加。【结论】骆驼蓬总碱对草地贪夜蛾卵巢细胞系Sf9有明显的毒杀活性,且对Sf9细胞中Na~+、K~+和葡萄糖的吸收具有抑制作用;对草地贪夜蛾4龄幼虫血细胞数量也有明显的抑制作用。     

AFB1对犬肝细胞的毒性作用及NAC的保护效应

【目的】以犬原代肝细胞为模型,研究黄曲霉毒素B_1(AFB_1)对肝细胞的毒性作用以及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对细胞损伤的保护效应。【方法】选取1～2月龄幼犬,取肝细胞培养至对数生长期,分别用0(对照),0.05,0.25,1.25,6.25,31.25μg/mL AFB_1和6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理36 h后,观察细胞形态结构,检测肝功能相关指标、氧化与抗氧化功能指标及细胞凋亡相关基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表达量。【结果】显微观察发现,与对照组相比,0.05～6.25μg/mL AFB_1处理组的细胞数量减少,细胞失去饱满性,细胞凋亡、坏死情况明显;6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组的细胞饱满且活性良好,细胞数目增加,结构完整。与对照组相比,1.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性均显著上升(P0.05);0.05～31.25μg/mL AFB_1处理组的碱性磷酸酶(ALP)活性显著升高(P0.05);1.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的γ-谷氨酰转移酶(γ-GGT)活性显著降低(P0.05),0.05～0.25μg/mL AFB_1处理组的γ-GGT活性显著增加(P0.05); 31.25μg/mL AFB_1处理组的白蛋白(ALB)质量浓度显著降低(P0.05)。与对照组相比,0.05～0.25μg/mL AFB_1处理组的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和丙二醇(MDA)含量显著增加(P0.05);1.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的H_2O_2质量浓度显著增加(P0.05)。与对照组相比,0.05～31.25μg/mL AFB_1处理组的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性无显著变化;0.25～31.25μg/mL AFB_1处理组的过氧化氢酶(CAT)活性显著降低(P0.05)。与6.25μg/mL AFB_1处理组相比,6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组的AST、ALP、r-GGT活性以及ALB、8-OHdG、MDA、H_2O_2水平显著降低(P0.05),CAT和GSH-Px活性显著升高(P0.05)。6.25μg/mL AFB_1处理细胞的凋亡率为12%,极显著高于对照组和6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组。与对照组相比,0.05～6.25μg/mL AFB_1处理组的cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA的表达量极显著增加(P0.01);与6.25μg/mL AFB_1组相比,6.25μg/mL AFB_1+64 mmol/L NAC处理组的cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表达量均极显著降低(P0.01)。【结论】AFB_1能够抑制犬原代肝细胞活性,引起细胞形态、肝功能指标及细胞氧化与抗氧化功能异常,加快细胞凋亡;NAC能够显著提高抗氧化酶活性,降低AFB_1所致肝细胞的损伤和凋亡水平,对肝细胞具有一定的保护性。     

6种生物碱对斜纹夜蛾离体培养细胞的作用方式

通过倒置显微镜观察斜纹夜蛾细胞凋亡小体,采用MTT法测定细胞增殖抑制作用,并使用流式细胞仪检测细胞周期时相,研究了骆驼蓬碱、喜树碱、蓖麻碱、苦参碱、博落回碱和烟碱对斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1的作用方式和细胞毒理。结果表明:骆驼蓬碱5.0μg/mL、20.0μg/mL和喜树碱0.5μmol/L、1.0μmol/L处理后48～60 h,斜纹夜蛾离体培养细胞系SL-1表现出明显的细胞凋亡诱导作用,处理后12～48 h,明显抑制SL-1细胞增殖,流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G2/M期;博落回碱和蓖麻碱5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用,以20.0μg/mL处理具有细胞周期时相阻滞作用,同样使细胞阻滞于G2/M期,但无明显的细胞凋亡诱导作用;烟碱和苦参碱在5.0μg/mL、20.0μg/mL对SL-1具有细胞增殖抑制作用。     

伏马毒素对细胞毒性作用的研究

研究了伏马毒素(Fumonisin,Fu)对叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-cell)的毒性作用。结果表明:随着Fu浓度递增,BHK细胞的活力下降至10%;Fu对BHK细胞DNA的损伤作用同样明显,40μg/mL剂量组的细胞拖尾率是正常对照组的80倍。40μg/mL Fu剂量组24 h后检测到特征性的凋亡梯形条带,正常对照组则未检测到。40μg/mL Fu剂量组24 h内细胞SOD活力降低至正常对照组的20%,培养液中MDA含量较正常对照组和4%乙醇对照组提高了7倍。     

印楝素A诱导Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化

利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术观察印楝素A诱导草地贪夜蛾Spodoptera frugperda蛹卵巢Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化.结果表明:1.5μg.mL-1印楝素A对Sf9细胞具有显著的凋亡诱导作用,从凋亡小体和贴壁细胞数量变化判断,印楝素A处理12 h,细胞开始出现少量凋亡小体,12~24 h凋亡小体逐渐增多,但贴壁细胞未见明显减少,因此24 h之前(0~24 h)属于凋亡早期阶段;24~36 h凋亡小体大量出现,贴壁细胞逐渐减少,属于凋亡中期;处理36 h以上,凋亡小体和贴壁细胞急剧减少,细胞凋亡进入晚期.观察诱导24 h的细胞超微结构发现,胞内的主要细胞器在数量或形态上发生了显著变化,包括溶酶体数量显著增加,线粒体内部嵴变模糊,内质网从囊泡状变成线管状,细胞核出现分页、皱缩以及区域性膨大等.     

金针菇多糖抑制肝癌HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡

MTT法检测金针菇多糖(FVP)在不同浓度(0,50,100,200,500,1 000μg/mL)及不同时间(24 h和48 h)对肝癌细胞HepG2增殖的影响;利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测FVP对肝癌细胞凋亡的影响; Hoechst33258荧光染色法检测细胞形态学变化;试剂盒法检测凋亡蛋白Caspase3、8、9活性变化。结果表明:FVP以剂效时效关系抑制细胞增殖,浓度在500,1 000μg/mL处理48 h后细胞抑制率分别为47. 2%和57. 1%。细胞凋亡率随着FVP浓度增高而增高,浓度为500μg/mL和1 000μg/mL时的凋亡率分别为33. 8%和40. 7%。FVP使细胞呈现致密、明亮、蓝色浓染的核固缩细胞凋亡变化,且镜下细胞数目随FVP浓度增加而减少。FVP能够同时使Caspase3、8、9活性蛋白表达增高,且呈浓度依赖性。FVP能抑制癌症细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制可能涉及线粒体及死亡受体途径,具体作用机制有待进一步研究。     

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立

[目的]采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型.[方法]体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件.倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT).[结果]与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组.[结论]建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80 μg/mL,作用时间12 h.     

玉米小斑病菌C小种毒素诱导玉米离体根冠细胞凋亡的检测

将玉米同核异质体不育细胞质CB37及其正常保持系NB37的离体根冠细胞分为4组,其中3组分别用质量浓度50μg/mL、100μg/mL和150μg/mL的玉米小斑病菌C小种(HMC)毒素诱导,1组用pH6.5PBS诱导作为对照,诱导时间分别为1h、4h和7h。然后采用中性红与伊文思蓝染色、吖啶橙(AO)与溴化乙啶(EB)复染和Hoechst33258染色3种方法检测玉米根冠细胞的凋亡状况。结果表明:HMC毒素诱导玉米根冠细胞发生凋亡,并出现凋亡小体与染色体边集形态特征。中性红与伊文思蓝染色,只能检测出活细胞和死细胞,且在3种毒素浓度、3种处理时间下,CB37的根冠细胞死亡率均高于NB37;采用AO与EB复染方法,用150μg/mLHMC毒素处理7h时,CB37细胞凋亡率达到最高值70.2%,而NB37仅为36.7%;经Hoechst33258染色后,CB37用150μg/mLHMC毒素处理7h时达到最大凋亡率为74.5%,而NB37为30.7%。专效性HMC毒素对C细胞质敏感,在毒素伤害细胞致死过程中,C细胞质的细胞死亡率远高于N细胞质;在诱导细胞凋亡程序中,C细胞质的细胞凋亡率也远高于N细胞质,且其凋亡率随...     

DNALadder和ELISA联合检测PRRSV诱导Marc145细胞凋亡动态变化规律的研究

对PRRSV诱导Marc145细胞凋亡的动态变化规律进行了研究,实验收集PRRSV SC1株感染Marc145细胞后0、24、48、72、96、120、144h和同一时间点未接毒的细胞样品,用DNALadder定性检测和ELISA定量检测细胞凋亡的变化规律。定性检测结果表明,PRRSV能诱导Marc145细胞发生凋亡,病毒感染后凋亡细胞DNA电泳呈典型“梯状”条带。定量检测结果表明,Marc145细胞在PRRSV感染后24h开始出现凋亡,48h凋亡更加明显,72h达到高峰,明显高于对照组。     

Role of Calcium Ion in Apoptosis of MD Cancer Cells Induced by Arsenic Trioxide

In order to observe the role of calcium ion in apoptosis of MD cancer cells induced by arsenic trioxide, inhibition percentage was detected by MTT assay; morphology changes were examined by fluorescence microscope; apoptosis was examined by DNA Ladder; [Ca^2＋]i was investigated by spectrofluorimeter in vitro on MDCC-MSB 1 cells. The results showed that As2O3 inhibited the proliferation of MDCC-MSB1 cells in concentration dependent manner （P〈0.05 or P〈0.01）; typical apoptosis character was observed by fluorescence microscope; DNA Ladder was observed; the [Ca^2＋]i was elevated significantly after the treatment of As203 （P〈0.05 or P〈0.01） and showed a dose-dependent manner. It is concluded that the calcium may play an important role in apoptosis of MD cancer cells induced by arsenic trioxide.     

斑蝥素对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用

本文采用MTT法检测斑蝥素对前列腺癌PC-3细胞增殖的抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态,研究斑蝥素对前列腺癌PC-3细胞体外增殖的抑制作用.结果表明,斑蝥素能明显抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖,且在浓度为1、2.5、5、10、15、20 μmol/L时,呈现浓度和时间依赖性;斑蝥素作用前列腺癌PC-3细胞24、48、72 h的IC50分别为9.91、4.07、1.40 μmol/L.可见斑蝥素对前列腺癌PC-3细胞增殖具有明显的抑制作用.     

中华蜜蜂AcerOr2基因昆虫表达载体pIB/V5-His的构建

为构建能稳定高效表达中华蜜蜂气味受体AcerOr2的重组表达载体,并在Sf9昆虫细胞中表达,将目的基因AcerOr2和昆虫表达载体pIB/V5-His用BamHⅠ和EcoRⅠ做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含目的基因AcerOr2的表达载体pIB/V5-His-AcerOr2。将重组DNA用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞中,利用Western blot和免疫荧光检测AcerOr2蛋白的表达和亚细胞定位情况。结果表明,成功构建重组表达载体pIB/V5-His-AcerOr2并建立稳定转染细胞系;Western blot结果证明,重组表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达,融合蛋白相对分子质量为56 ku左右;免疫荧光显示,重组表达载体在Sf9细胞膜上表达,与预测结果一致。说明构建的重组表达载体pIB/V5-His-AcerOr2能在Sf9细胞中稳定表达,为进一步研究中华蜜蜂气味受体AcerOr2的功能奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.     

ROS对氯化镉诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

为研究活性氧(ROS)对氯化镉(CdCl2)诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响,本文采用荧光探针DHR检测CdCl2诱导的MCF-7细胞内ROS的变化水平;分别采用MTT法和DNA Ladder法检测CdCl2对细胞的毒性作用和细胞DNA的凋亡情况;通过加入自由基清除剂LNAC抑制细胞内的ROS水平,从而研究ROS对细胞凋亡的影响。结果显示,1.00×10-3 mol/L的CdCl2处理MCF-7细胞6h,细胞内ROS水平为对照组的2.04倍,细胞存活率为26.54%,DNA出现片段化分解。用CdCl2+LNAC复合处理MCF-7细胞6h,细胞内ROS水平为对照组的1.25倍,细胞存活率为61.17%,DNA不出现凋亡条带。因此,由CdCl2所导致的MCF-7细胞凋亡和DNA片段化分解,与细胞内ROS水平的升高有关。     

外源bcl—2基因和脂质体对鸡卵泡颗粒细胞体外分裂和凋亡的影响

选用正在产蛋的罗曼鸡，取其排序第3的卵泡分离层颗粒层细胞，用含血清培养基培养，并用含脂质体每孔0．0，0．6，1．2，2．4，4．8μL和bcl-2基因重组质粒每孔0．2μg转染卵泡颗粒细胞。用流式细胞术等方法分析转基因后的源代细胞和传代细胞的生长与凋亡情况。结果发现，与未转染组相比，转染后的传代细胞分裂速度较快（P＜0．01）、凋亡比率较低，G2／M＋S期细胞极显著高于对照（P＜0．01），且与脂质体浓度有剂量依赖关系。在转染时间为12h、DNA含量为每孔0．2μg的条件下，脂质体最佳转染浓度为每孔1.2μL。这些结果进一步证明，外源bcl-2基因或脂质体具有促进细胞分裂、抑制细胞凋亡、延长细胞寿命的作用。     

红树内生真菌BYY-1中一个酚类化合物的分离鉴定与抗肿瘤活性

采用硅胶柱层析、薄层层析、Sephadex LH-20柱层析从红树内生真菌BYY-1的次级代谢产物中分离到化合物B1.通过乙酰化、NMR、HR ESI-Q-TOF MS等技术鉴定了化合物B1的结构,确定其为首次从红树内生真菌中分离到的化合物.运用MTT法和流式细胞术研究了化合物B1的抗肿瘤活性,结果表明,化合物B1可显著抑制Hela细胞的增殖（IC50=3.3μg/mL）,并且质量浓度为4μg/mL时,能诱导Hela细胞发生明显的凋亡.     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达

利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。