细胞分裂素对水稻分蘖芽生长及分蘖相关基因表达的调控

【目的】研究细胞分裂素（CTK）和分蘖相关基因表达在调控水稻分蘖芽生长过程中的相互关系,探讨水稻分蘖芽生长的分子机理。【方法】以南粳44为材料,利用氮（N）和生长素（IAA）调控水稻分蘖芽萌发,分析OsTB1、OsD3、OsD10和OsD27的表达和CTK含量的变化。【结果】外源40 mg•L-1N增加了分蘖节和分蘖芽中CTK含量,抑制了分蘖芽中OsTB1、OsD3、OsD10和OsD27的表达,促进了分蘖芽的萌发生长,外源喷施IAA则逆转了氮的作用。分蘖芽中OsTB1的表达受CTK调控,而OsD3、OsD10和OsD27的表达可能不受CTK调控。【结论】外界因素对分蘖芽生长的调控至少存在2条途径,一条是通过调控节和芽中CTK含量,进而调控芽中OsTB1等基因表达;另一条通过调控OsD3、OsD10和OsD27的表达。     

大白菜雌不育突变体fsm花蕾激素代谢的转录组分析

以大白菜DH系FT为试材,通过游离小孢子培养结合EMS诱变处理,创制出一份雌性不育突变体fsm。与野生型FT相比,fsm花器官瘦小、子房干瘪、胚珠败育、自交和杂交均不结子。雌蕊的石蜡切片显示fsm中央隔膜融合异常,胚珠数量减少。内源激素测定显示,突变体fsm花蕾的生长素和油菜素内酯含量显著增高、细胞分裂素显著降低。根据转录组测序分析,差异表达基因(DEGs)主要在内源性刺激反应、非生物刺激反应、细胞膜组分和细胞外周等GO功能条目富集。KEGG分析将6921个差异表达基因比对到275条代谢途径,其中,显著富集的代谢途径包括新陈代谢、次生代谢物合成、植物-病原体互作和植物激素信号转导。YUCCA基因的表达上调可能是生长素含量增多的关键因素。激素代谢途径中,大量AUX1/IAA、GH3、SAUR和PIN类基因表达下调,可能使生长素转运受到抑制,导致雌蕊生长受阻。细胞分裂素代谢通路中,CUC、STM、WUS和CKX基因表达下调。花蕾中油菜素内酯含量增高,而BRI1类基因表达下调,表明突变体fsm可能是BR不敏感突变体,SEUSS-LIKE3和CYP85A2基因的表达下调可能导致雌蕊输导组织融合缺陷。突变体花蕾中激素间相互作用的紊乱可能是雌蕊发育异常的重要原因。利用qRT-PCR对激素代谢通路的25个差异表达基因进行验证,其表达模式与RNA-seq结果一致。研究结果为深入分析大白菜雌性不育突变体fsm雌蕊败育机理提供了重要参考价值,也为探究突变基因的生物学功能奠定了基础。     

水稻染色质重塑因子CHR729对激素代谢的影响

CHR729是水稻(Oryza sativa L.)CHD3类染色质重塑因子,广泛参与水稻生长发育进程,并影响全基因组明显表达和组蛋白修饰,测定了多种植物内源激素在chr729突变体中的含量,探讨了CHR729与激素代谢之间的联系。结果表明,在苗期地上部分和成熟期剑叶中,chr729突变体内源生长素(IAA),脱落酸(ABA),茉莉酸(JA)含量明显降低,生长素合成以及ABA合成基因的表达在chr729突变体中均呈下调表达。树脂切片结果显示,chr729突变体中茎秆成熟组织细胞明显变小,居间分生组织细胞大小无明显变化。苗期检测细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CKX)基因表达发现,chr729突变体中CKX1、CKX2、CKX4基因表达量升高,伴随一些位点组蛋白变体H2A.Z富集程度的上升,表明CHR729可能抑制H2A.Z在基因组上的装载,广泛参与水稻激素代谢调控。     

生长素促进拟南芥AtNRT1.1基因表达增强硝酸盐吸收

为研究生长素信号对植物硝酸盐营养吸收的调控作用,采用扫描离子选择电极技术 (SIET) 和实时荧光定量 PCR 技术(qRT-PCR),测定拟南芥野生型Col-0、生长素过表达突变体yuc1-D以及生长素通路缺失突变体axr1-12 3种株系初始根中硝酸根离子(NO-3)吸收速率以及硝酸盐转运蛋白基因AtNRT1.1表达量的差异,并进一步检测Col-0株系以及硝酸盐转运蛋白突变体nrt1.1株系在正常条件(CK)或施加外源IAA及生长素极性运输抑制剂2,3,5 三碘苯甲酸(TIBA)处理下的NO-3流速和AtNRT1.1基因表达量的差异。结果表明:yuc1 D株系的NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量相比野生型均有大幅增加,而axr1-12株系的 NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量相比野生型显著降低;在Col-0株系中施加外源IAA对NO-3吸收速率以及AtNRT1.1基因表达量有明显促进作用,而施加TIBA的效果反之,说明生长素对硝酸盐吸收有增强效应。nrt1.1株系在CK、IAA、TIBA处理下NO-3吸收速率差异较野生型不明显,揭示了AtNRT1.1基因在生长素促进硝酸盐吸收途径中所起的重要作用。      

航天诱变水稻雌性半不育突变体rs(s)的变异特性分析

【目的】揭示航天诱变水稻雌性半不育的变异特性。【方法】以常规籼型水稻‘秋B’(野生型)航天搭载诱变获得的雌性半不育突变体rs(s)为研究对象，对其开展形态学、细胞学、生理学和遗传学研究。调查突变体与野生型及其正反交F₁、F₂群体结实率，对亲本的花粉和胚囊育性进行细胞学观察，测定突变体与野生型幼穗生长素(IAA)、细胞分裂素(TZR)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA₃)的含量变化。【结果】突变体rs(s)雄蕊发育正常但雌性半不育，该性状受隐性单基因调控；发育过程中子房干瘪瘦小，柱头伸长不明显，雌蕊在胚囊发育的有丝分裂阶段发生异常，导致胚囊败育；IAA含量在突变体幼穗分化第6阶段急剧增加。【结论】突变体rs(s)是一个新的雌性半不育突变体，在有丝分裂阶段生长素含量急剧增加，可能抑制了雌蕊的生长发育，导致雌蕊发育畸形、雌性半不育。     

基于RNA-Seq的拟南芥不定芽再生过程的基因表达谱分析

[目的]本研究旨在分析拟南芥愈伤组织形成和不定芽再生2个阶段基因的差异表达情况,探究不定芽再生背后的相关基因调控机制。[方法]采用拟南芥不定芽再生两步培养法培养根外植体,利用RNA-Seq高通量测序技术分别对愈伤组织诱导培养基(CIM)培养0 d根外植体(C0)、CIM培养4 d根外植体(C4)、芽诱导培养基(SIM)培养3 d根外植体(S3)进行基因测序,利用软件分析基因表达情况。[结果]将C4的基因表达量和C0进行比对,共检测到4 332个差异表达基因,其中1 399个基因表达上调,2 933个基因表达下调;在不定芽再生阶段(S3与C4的基因表达量进行比对)检测到2 910个差异表达的基因,其中2 231个基因表达上调,679个基因表达下调。对差异表达基因进行转录物功能注释分析发现:明显富集的功能分类多与激素合成、代谢等生物过程有关。在愈伤组织形成阶段一些与细胞分裂素分解代谢相关的CKX基因和与生长素活性相关的GH3家族基因表达量明显增加,而与细胞分裂素合成相关的多个基因表达量却明显降低。在不定芽再生阶段与细胞分裂素合成相关基因表达量明显增加,CKX家族部分成员表达量则明显降低。同时,还发现多个转录因子基因表达量在不同阶段发生显著变化,比如AP2/EREBP家族的部分成员。[结论]对拟南芥不定芽再生过程基因表达谱进行检测和对比分析,获得了大量基因表达谱分析数据,为揭示不定芽再生过程的基因调控机制提供了有效的数据和理论依据。     

拟南芥液泡分拣蛋白AtVPS25调控植物生长素响应的功能分析

【目的】鉴定生长素胁迫条件下纯合突变体vps25的表型,获得拟南芥液泡分选蛋白AtVPS25的互作蛋白,并分析AtVPS25和其互作蛋白在生长素响应过程中的功能及其分子机制。【方法】根据“三引物法”鉴定突变体;通过观察拟南芥vps25突变体在外加生长素的培养基上的表型,鉴定AtVPS25的功能;以AtVPS25为诱饵蛋白,采用泛素分离系统筛选在拟南芥中与其互作的蛋白;利用酵母互作试验和双分子荧光互补试验（BiFC）验证AtVPS25与AtAIR12（for Auxin-Induced in Root cultures）的互作关系;鉴定AtVPS25和AtAIR12蛋白在植物细胞中的定位情况;采用Real-time PCR方法,分析在生长素处理条件下,部分生长素运输相关基因在拟南芥vps25突变体中的表达变化。【结果】Real-time PCR结果显示,10 μmol•L-1 IAA处理条件下,在野生型拟南芥（WT）中,AtVPS25的表达量随着胁迫时间的增长而增高,并在12 h达到最高,约为0 h的40倍,证明AtVPS25受生长素处理的诱导表达。利用泛素分离系统筛库获得AtVPS25的互作蛋白AtAIR12、AtVPS25与AtAIR12全长蛋白序列的酵母双杂交试验证明AtVPS25与AtAIR12互作。亚细胞定位试验证明AtVPS25定位在细胞膜和细胞质中,AtAIR12定位在细胞膜及叶绿体膜上。BiFC（双分子荧光互补）试验结果显示,AtVPS25蛋白与AtAIR12蛋白互作,并且互作位点在细胞膜和细胞质中。突变体鉴定获得纯合突变体vps25。vps25在0.1 mg•L-1 IAA条件下生长,表现为主根伸长受到抑制,并且相对同一条件下的WT的主根长度差异极显著（P＜0.01）,而同时侧根数无明显差异,这与已报道的air12-1突变体在生长素处理条件下的表型相似。10 μmol•L-1 IAA处理时,在WT背景条件下,AtAIR12的表达量对IAA响应明显,并且随着胁迫时间的增长而增高,在12 h时达到最高,约为0 h的80倍,证明10 μmol•L-1 IAA处理条件下,WT中AtAIR12表达量的变化趋势与AtVPS25完全相同。同时在vps25突变体背景条件下,AtAIR12的表达相对于WT受到抑制,在0-24 h表达量无明显变化。此外,在vps25突变体背景条件下,生长素输出载体基因AtPIN2相对于WT中表达量降低,生长素输入载体基因AtLAX2相对于WT中表达量提高。【结论】拟南芥液泡分拣蛋白基因AtVPS25受IAA诱导表达,参与调控植物主根的发育,AtVPS25可以与生长素响应蛋白AtAIR12在细胞质和细胞膜上互作,AtVPS25调控部分生长素相关基因的表达,AtVPS25通过调控这些下游基因的表达影响生长素在根部的响应。AtVPS25与AtAIR12的调控机制需要进一步深入研究。     

拟南芥突变体kea的表型分析及对生长素的响应特征

对拟南芥kea突变体表型分析的结果表明,在黑暗条件下,单个KEA缺失后下胚轴和主根伸长与野生型相比没有明显差异,而多个KEA缺失导致幼苗出现去黄化现象,表现为下胚轴伸长受到抑制,子叶完全打开,真叶开始出现,主根发育良好。qRT-PCT结果表明,呈现去黄化现象的kea多突变体内生长素合成基因IAA1、IAA3、IAA17的表达下调,而生长素转运基因AUX1、PIN1、PIN3、PIN7的表达没有明显变化。外源施加生长素类似物NAA能够恢复kea多突变体去黄化现象。上述结果暗示KEA在调控拟南芥光调控发育的某些方面发挥重要作用。     

水稻胚乳突变体b140的表型分析及基因克隆

[目的]对水稻粉质胚乳突变体b140进行表型分析和基因克隆,为阐明水稻淀粉合成机制奠定基础。[方法]以粳稻品种‘W017’为野生型,测量‘W017’和突变体b140的农艺性状,分析籽粒的灌浆期干物质积累量和理化性质,并观察淀粉颗粒的结构;构建b140与‘南京11’的F2群体,取隐性极端个体定位基因;利用qRT-PCR测定籽粒灌浆时期的淀粉合成相关基因表达量;测定相关淀粉合成酶活性。[结果]b140表现为粉质胚乳,粒宽、粒厚和千粒质量均显著低于野生型,但粒长和其他农艺性状无显著变化。b140种子的总淀粉和直链淀粉含量均显著低于野生型,而可溶性糖含量显著高于野生型。扫描电镜观察b140胚乳淀粉粒呈球形或不规则形状,排列疏松。突变基因定位在第1号染色体短臂56 kb的区间内,测序发现只有1个已知基因Os01g0179400发生突变。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,b140胚乳中淀粉合成相关基因的表达量出现不同程度的下调。b140胚乳中腺苷磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性显著低于野生型。[结论]b140由于Os01g0179400基因发生突变,导致粉质胚乳表型。Os01g0179400突变影响了淀粉合成相关基因的表达以及腺苷磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性。b140的发现对于了解水稻淀粉合成和调控的机制具有一定的意义。     

烟草中异源表达AtPAP2对细胞分裂素敏感性的影响

[目的]本文旨在研究黄酮类化合物含量的变化对植物幼苗中细胞分裂素的响应。[方法]以稳定遗传的35S∷AtPAP2转基因烟草作为试验材料,以细胞分裂素典型的生理效应(抑制主根伸长生长和诱导离体叶片不定芽的再生)为试验模式系统,研究转基因烟草对细胞分裂素的响应。通过分析内源黄酮类化合物的含量,并结合外源施用,初步分析转基因烟草对细胞分裂素敏感的可能机制。[结果]6-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)(0.2～2.0μmol·L~(-1))和植物体内天然存在的细胞分裂素(反式玉米素和异戊烯基腺嘌呤)处理野生型和转基因烟草,均抑制主根的伸长生长,对转基因烟草的抑制效应明显强于野生型,表明转基因烟草对细胞分裂素的响应更敏感。6-BA处理3 h后,可诱导野生型和转基因植物细胞分裂素响应基因ARR的表达,6-BA的诱导效果在转基因植株上更显著。利用细胞分裂素诱导离体叶片不定芽再生的试验系统,发现转基因烟草长愈伤组织的叶片比例和离体叶片上长芽的平均数均高于野生型,也表明转基因烟草对细胞分裂素的响应更敏感。通过UPLC分析发现,转基因烟草中槲皮素含量明显高于野生型。在培养基中添加50μmol·L~(-1)槲皮素也可以提高野生型烟草幼苗对细胞分裂素的敏感性,而添加生长素极性运输抑制剂2,3,5-三碘苯甲酸和萘基邻氨甲酰苯甲酸则显著增强6-BA对主根伸长生长的抑制效应。[结论]在烟草体内过表达AtPAP2基因,可以提高内源槲皮素的含量,进而通过影响生长素的极性运输来调节植物对细胞分裂素的敏感性。     

水稻早衰突变体zs的鉴定与基因定位

[目的]本研究旨在对水稻叶片早衰突变体zs进行遗传分析及基因定位,探索水稻叶片早衰的分子机制。[方法]从甲基磺酸乙酯(EMS)诱变‘宁粳1号’突变体库中筛选鉴定了1个稳定遗传的早衰突变体zs,构建突变体zs与籼稻品种‘N22’的F2群体,对控制突变性状的基因进行定位,利用RT-q PCR对叶绿素合成以及质体发育相关基因的表达水平进行分析。[结果]突变体zs在28℃条件下生长14 d时,zs第2叶叶尖出现黄褐色斑点,并逐渐向叶基部蔓延。突变体zs叶绿素a和叶绿素b含量明显下降。zs叶肉细胞结构异常,叶绿体中类囊体片层结构排列松散。与野生型相比,zs的株高、分蘖数和千粒质量均显著降低。通过构建遗传分离群体,将突变基因定位在第12号染色体短臂上的600 kb的区间内。此区间内含有2个已报道的与叶片衰老相关的基因LOC_Os12g16410和LOC_Os12g16720,分别编码异黄酮还原酶和细胞色素单加氧酶(P450)。测序分析发现,仅在LOC_Os12g16720第2外显子上有1个单碱基突变,导致苏氨酸突变为甲硫氨酸。zs叶绿素合成相关基因和质体发育相关基因的表达量显著低于野生型。[结论]鉴定了1个早衰突变体zs,通过精细定位与序列分析,将LOC_Os12g16720作为候选基因,该基因可能参与调控叶绿素合成及质体的发育。     

外源赤霉素对太子参块根中细胞分裂素含量 及其代谢关键酶基因表达的影响

[目的]分析外源赤霉素(GA3)对太子参块根中细胞分裂素(CTK)含量变化及其代谢关键酶基因表达的影响,为研究太子参块根膨大发育机制提供理论基础.[方法]将盆栽的太子参幼苗分成4组,其中3个处理组分别根灌150 mg/L GA3(GA3处理组)、20 mg/L多效唑(PBZ)(PBZ处理组)和150 mg/L GA3+20 mg/L PBZ(GA3+PBZ处理组)激素溶液各200 mL,对照组根灌等量清水,在不同块根发育期采集块根样品.运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同处理时间太子参块根中内源玉米素核苷(ZR)的含量,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CTK代谢关键酶基因的表达量变化.[结果]在整个块根发育期,3个处理组太子参块根中的ZR含量总体高于对照组,且呈相同的变化趋势,即从膨大初期到成熟期ZR含量均呈升高—降低—升高的变化趋势,说明外源GA3和PBZ均能促进ZR含量的升高.在GA3处理组中,A-IPT1基因的表达量在膨大初期较对照组高,随着块根的膨大,其表达量呈先升高后降低的变化趋势,直至成熟期低于对照组;tRNA-DMATase基因的表达量在膨大初期较对照组低,随后不断上升高于对照组,呈先升高后降低的变化趋势;A-IPT2基因的表达量在整个太子参块根发育期略高于对照组,而CYP735A、CKX1和CKX2基因表达量均低于对照组.在PBZ处理组中,A-IPT1、tRNA-DMATase和CKX2基因的表达量变化趋势与GA3处理组相反.GA3+PBZ处理组A-IPT2、CYP735A、CKX1和CKX2基因的表达量均明显高于其他组,且与对照组的变化趋势相似.外源GA3可上调A-IPT1和tRNA-DMATase基因的表达水平,下调CYP735A、CKX1和CKX2基因的表达水平,结合ZR含量测定结果可推测CTK在块根膨大初期合成反式玉米素(tZ),而在成熟期合成顺式玉米素(cZ).[结论]GA3调控CTK的合成和分解是一个动态过程,GA3抑制太子参块根膨大,可能与不同发育时期CTK的代谢有关.     

缩行匀株对小麦分蘖的影响及其生理机制

为明确缩行匀株（row space reduction and plant space expansion,RRPE）对冬小麦分蘖的影响及其生理机制，于2019-2021年小麦种植季，以‘马兰1号’为供试品种，设置2个行距和3个播期，研究RRPE处理对小麦冬前分蘖数和生物量的影响，及分蘖节内源激素和蔗糖对RRPE的响应特征。结果表明，RRPE处理能促进小麦冬前分蘖数（tillers number,TN）和生物量，平均增加14.5%和20.9%，并增加≥3叶的分蘖数；RRPE处理降低了3叶期至越冬期小麦分蘖节吲哚乙酸（indoleacetic acid,IAA）、独脚金内酯（strigolactones,SLs）、赤霉素（gibberellin,GA）和油菜素甾醇（brassinosterol,BR）含量，分别平均降低19.4%、17.5%、11.4%和13.6%;RRPE处理显著提高了玉米素核苷（zeatin nucleoside,ZR）、细胞分裂素（cytokinin,CTK）和蔗糖（saccharose,SA）含量，平均提高13.1%、54.4%和15.2%。RRPE处理还降低了I...     

黄瓜有限生长调控基因CsCML25的启动子克隆及功能分析

[目的]本文旨在通过对黄瓜有限生长调控基因CsCML25启动子功能的研究,揭示该基因在黄瓜有限生长过程中的转录调控机制。[方法]以黄瓜自交系材料CCMC的叶片DNA为模板,克隆CsCML25上游的全长启动子序列,并对其顺式调控元件进行分析;构建CsCML25基因过表达载体以及CsCML25启动子驱动GFP报告基因的表达载体,通过农杆菌介导遗传转化法将其转化拟南芥后,观察过表达植株表型并利用荧光显微镜观察GFP的表达规律;采用RT-qPCR分析该CsCML25启动子驱动的GFP报告基因在IAA和6-BA处理后以及在调控拟南芥有限生长基因TFL1影响下的表达变化。[结果]CsCML25启动子全长2 979 bp,包括4个MYB转录因子结合位点、1个WUS结合位点以及多个细胞分裂素、生长素和光响应元件。过量表达CsCML25基因能够造成拟南芥顶端花融合现象,形成与拟南芥突变体tfl1-13相似的有限生长表型。CsCML25启动子驱动GFP在茎尖分生组织、叶原基、花原基以及花瓣等组织部位表达。RT-qPCR结果表明:IAA和6-BA处理能够显著影响CsCML25启动子的转录激活功能;拟南芥有限生长突变体tfl1-13杂交试验显示,TFL1的失活会降低CsCML25启动子驱动GFP表达的能力。[结论]CsCML25基因是调控有限生长的关键基因,在茎尖分生组织和幼嫩器官中特异性表达,其启动子转录活性受细胞分裂素和生长素的抑制;突变体杂交试验也证明有限生长调控基因TFL1可能通过调控CsCML25启动子的转录活性,进而影响植株的形态建成。     

水稻高节位分蘖的形态特征及遗传行为

穗数、每穗粒数和千粒重是构成水稻产量的三要素，分蘖是穗数的重要构成因素，高节位分蘖是水稻的一种特殊分蘖方式。以野生型水稻R818及其高节位分蘖突变体W33为试验材料，采用盆栽和大田试验，研究水稻高节位分蘖的形态特征及其遗传行为。结果表明:①幼苗期，W33的株高、叶片大小、根条数、根长与R818无显著差异。②分蘖前期，W33已出现明显二次分蘖；分蘖中后期，R818的分蘖芽逐渐进入休眠状态，而W33除穗颈节外的其他节位，分蘖芽仍处于活跃状态，二者的株高、主茎叶长及一、二、三、四次分蘖数差异显著或极显著；至抽穗期，W33的单株平均分蘖数达到79.7个，是R818分蘖数的7.5倍。③R818和W33的平均单穗谷粒数和单穗产量差异显著，但单株产量无显著差异。④W33与R818的正反交F1均无高节位分蘖；正反交F1与W33的回交后代表现为无高节位分蘖和有高节位分蘖两种表型，经2检验，其分离比均符合1∶1；正反交F2均表现为无高节位分蘖和有高节位分蘖两种表型，经2检验，其分离比均符合3∶1。表明W33的高节位分蘖能力旺盛，分蘖中后期的一、二、三、四次分蘖数显著或极显著高于R818；高节位分蘖特性表现为单基因隐性遗传。研究结果可为水稻高节位分蘖研究与利用提供理论参考。     

Ath-miR169d介导的拟南芥叶片发育的分子调控机制

【目的】探究ath-miR169d在拟南芥叶片发育过程中的作用,明确其调控的分子机制,为增强叶菜类植物的光合效率以及增加生物量和提高作物产量提供理论依据。【方法】选取ath-miR169d过表达和降低表达的拟南芥转基因株系以及野生型拟南芥,在22℃、相对湿度60%、16 h/8 h光周期条件下培养,观察不同生长阶段叶片发育表型的差异;同时构建pmiR169d::GUS表达载体,转化农杆菌EHA105,并利用蘸花法转化野生型拟南芥(Columbia,Col-0),获得转基因拟南芥,利用GUS染色对ath-miR169d在拟南芥不同组织器官中的表达模式进行研究;选取8周龄的过表达材料和野生型对照株系,对其叶片表皮细胞形态进行扫描电镜分析;对4周龄过表达材料和野生型对照株系的幼苗顶端分生组织和叶片中总IAA进行定量分析,并进行基因芯片表达谱分析,筛选差异表达基因;通过实时荧光定量PCR对生长素信号途径部分差异表达关键基因的表达情况进行分析。【结果】Ath-miR169d过表达拟南芥株系莲座叶数目较野生型少,叶片小,而ath-miR169d降低表达的拟南芥株系的莲座叶较野生型多,叶片大,且在抽薹和种子成熟之后还持续长出新叶,而野生型莲座叶则在种子成熟之后逐渐衰老干枯;扫描电镜观察到ath-miR169d过表达拟南芥株系叶片中表皮细胞小于野生型;表达模式分析表明,ath-miR169d主要在顶端分生组织(shoot apical meristem,SAM)和叶片维管系统中表达,且新叶中表达强。SAM是产生生长素的部位,IAA测定结果表明ath-miR169d过表达拟南芥株系中IAA含量显著降低,为野生型植株的38.6%,同时基因芯片表达谱分析也验证了ath-miR169d参与调控植物体内激素信号转导途径。进一步研究发现,ath-miR169d过表达株系中生长素合成关键基因YUC2和转运体蛋白基因PIN1均显著下调表达,而具有转录抑制功能的生长素响应因子1和2基因(ARF1和ARF2)表达上调;STTM miR169d低表达株系中这4个基因的表达则为相反趋势,该结果与观察到的表型相一致。【结论】Ath-miR169d通过介导生长素信号途径参与了拟南芥叶片发育的调控,ath-miR169d表达量发生变化会影响叶片的数量和大小,最终影响整个植株的生物量。     

影响水稻雌雄配子发育的基因图位克隆

[目的]水稻的育性对产量有非常重要的影响,对水稻雌、雄不育(female and male sterility)突变体fms进行表型研究和基因图位克隆以丰富水稻生殖发育的分子机制。[方法]用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)化学诱变粳稻品种‘宁粳4号’,获得1个稳定的雌、雄不育突变体fms,利用醋酸洋红染色、半薄切片和激光共聚焦显微技术对野生型和突变体的花药和胚囊进行细胞学观察和比较;利用FMS/fms杂合子和‘N22’杂交构建的F2群体进行遗传分析和基因图位克隆。[结果]细胞学观察发现:fms的花药壁中绒毡层和中间层缺失,花粉母细胞发育停滞,导致雄配子完全不育;突变体胚囊发育早期孢母细胞增多,成熟胚囊完全退化或出现多于8个的细胞核,导致雌配子不育。遗传分析表明,该不育性状由1对隐性核基因控制。通过图位克隆将FMS基因初步定位在第12号染色体长臂上的分子标记RM27877和RM28404之间。进一步扩大群体并加密分子标记,最终将候选基因定位在标记Ta-4和Ta-7之间,物理距离818 kb,该区间内预测有13个开放阅读框。基因组测序结果显示,fms在Os12g0472500的第1个外显子上有1个碱基突变,使色氨酸变成终止密码子,造成翻译提前终止。表达分析显示FMS在花药中特异性高表达,在胚囊中表达量较高。[结论]水稻育性突变体fms突变性状由Os12g0472500基因的隐性突变引起,该基因编码的蛋白影响水稻花粉和胚囊的发育。     

苹果MdRGL1a基因对烟草遗传转化研究

植物DELLA蛋白是赤霉素信号传导途径的反向调节因子,DELLA蛋白突变体导致植株矮化。苹果MdRGL1a是编码苹果DELLA蛋白家族的基因之一,为了研究该基因的生理功能,用从‘威赛克’苹果中克隆的MdRGL1a基因,分别构建GFP瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪法轰击洋葱表皮细胞,激光共聚焦显微镜下观察MdRGL1a基因的亚细胞定位。利用农杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草(Nicotianna tabacumL.),对转基因烟草进行PCR扩增和GUS染色法检测,观察转基因烟草的形态学性状,利用ELISA方法测定烟草的内源激素水平。结果表明,MdRGL1a-GFP融合蛋白定位在细胞核内。转MdRGL1a基因的烟草组培苗根短粗、根系小,田间生长表现为植株矮化,75%转基因烟草提早开花。50%以上转基因植株的內源生长素和细胞分裂素水平显著低于对照非转基因烟草,而內源ABA水平显著高于对照。过量表达MdRGL1a导致转基因烟草植株的矮化和花期改变与內源激素生长素、细胞分裂素水平降低和ABA水平提高相关。     

大豆矮化突变体苗期表型观察及对外源激素的响应

以‘菏豆12'及其~(60)CO-γ射线诱导矮化突变体为材料,研究突变体的第一复叶叶柄长度、苗期株高、叶柄显微结构,利用4种外源激素处理根系,初步探查突变基因的类型。结果表明:该突变体叶柄比野生型短,株高矮,整体紧凑。叶柄横切观察发现,该突变体木质部细胞及髓细胞直径变小。根系对6-苄氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA_3)、吲哚乙酸(IAA)非常敏感,对油菜素内酯(BR)无应答,表明该突变体可能是BR信号转导出现障碍,后续目标基因发掘应围绕BR信号转导途径的相关基因展开。矮化短叶柄突变体在大豆理想株型改造与大豆分子育种中可能具有潜在利用价值。