三角帆蚌外套膜细胞培养的改进与大型有核珍珠的培育研究

为得到大颗粒优质的淡水有核珍珠,进行了游离细胞植入法在三角帆蚌(〖WTBX〗Hyriopsis cumingii〖WTBZ〗)内脏团插核育珠的研究。实验采用两种培养基(培养基1、2)进行外套膜外膜细胞的培养,对不同培养时间(2、4、6、12 h)的细胞活力进行检测,同时将处理过的珠核分别置于两组细胞悬液中共培养,6 h后采用内脏团插核手术,对500只三角帆蚌进行插核,并进行为期5个月的淡水有核珍珠生产实验。实验结果表明：细胞活力随培养时间逐渐增大,培养到6、12 h时,两种培养基中的细胞活力较2、4 h时均有显著提高(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.05),6 h与12 h相比差异不显著(〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05);细胞在两种培养基中分别培养,在培养2 h时两组间细胞活力没有显著差异(〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05),而在培养4、6、12 h时培养基2组的细胞活力显著高于培养基1组(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.05);培养基2组培养的细胞孵育珠核6 h后,贴附的细胞数量明显增多且分布均匀,插核5个月后,形成了包裹完整、具有光泽、沉积0.8 mm珍珠质的大型珍珠,而采用培养基1组培养的外套膜细胞进行珠核孵育而后插核,得到的素珠较多,且没有形成完整珍珠质包被的珍珠。实验表明改进后的培养基有利于三角帆蚌外套膜细胞培养,从而有利于内脏团有核珍珠的培育,这为进一步开展淡水贝类细胞培养的研究提供了实践基础,为大型有核珍珠的培育提供了依据。     

注射法培育三角帆蚌有核珍珠的研究

对三角帆蚌有核珍珠培育方法作了研究。珍珠囊体外培育采用胰蛋白酶对外套膜组织块进行解离，收集细胞悬液于珠核上培养珍珠囊，然后将体外形成的有核珍珠囊再者插核，并将酶解处理后的细胞悬液注射到所插核部位。结果表明，外套膜组织细胞悬液贴核生长正常，并且能够培育出体外珍珠囊；将体外珍珠囊插到母蚌外套膜内，同时注射外套膜组织细胞悬液，经60天养殖后，可以看到在珠核外面已有珍珠层开始沉积。     

正圆形珠核规格与育珠蚌体长的匹配试验

报导了在三角帆蚌内脏团植入正圆形珠核与蚌体长之间的匹配实验结果。比较了不同规格的蚌体对有核珍珠留核率、成珠率、尾巴珠率、光洁度、光泽度、正圆度及珍珠等级的影响。实验结果表明,对于8.00～8.25 mm的珠核而言,植入12.0～12.2 cm的蚌体的内脏团效果比较理想。     

三角帆蚌EF-hand基因的表达研究

淡水贝类包含EF-hand结构域的蛋白质对Ca~(2+)代谢具有重要的调控作用,加强EF-hand蛋白的研究对培育大型优质珍珠具有十分重要的意义。通过三角帆蚌转录组筛选到7个EF-hand基因,并进行生物信息学分析;通过数字基因表达谱(DGE)分析了这7个基因在不同育珠时间两个育珠组织(外套膜和内脏团)中的表达趋势;通过Real-time Q-PCR技术对EF-hand基因进行了表达研究。结果表明,三角帆蚌7个EFhand基因都具有经典保守的EF-hand模块。进化树分析表明,EFCB1和EFCB6进化关系最近,EFCB7和N-EFCB1进化关系较近,EFCBD2和RASEFCB进化关系较近。DGE表达趋势分析表明三角帆蚌EF-hand基因在外套膜和内脏团组织不同育珠时期表达变化趋势差异较大,说明这7个基因在珍珠形成过程中的功能可能各不相同。荧光定量PCR结果表明,EF-hand基因在插核后不同时期的外套膜和内脏团育珠部位组织中表达与DGE表达趋势分析基本一致。EFCB1在外套膜插核后20 d表达水平最高(P0.05),EFCB6和EFCB7在内脏团插核后20 d表达水平最高(P0.05),表明这3个基因在珍珠质最初分泌形成过程中可能起着重要的作用,为进一步探索该类蛋白调控钙代谢及在珍珠形成过程中的作用奠定了基础。     

三角帆蚌生长性状和内壳光泽度与所育有核珍珠光泽度相关性分析

光泽度为衡量珍珠价值上限的指标,为了研究三角帆蚌供片蚌和育珠蚌对有核珍珠光泽度的相对贡献,以白蚌（内壳主体色为白色的三角帆蚌）为材料,以壳长和外壳青色为选择性状,设置不同选择策略,建立8 组三角帆蚌群体,在每组群体随机选出供片组和育珠组,开展组合插核手术。经18个月培育,发现不同育珠组合中,供片蚌和育珠蚌同时来自 Ⅰ 组选择群体的YAA育珠组合所育珍珠光泽度值最大,比YGG、YHH产珍珠光泽度分别提高15.46%、21.51%;不同组供片蚌培育珍珠的光泽度差异显著,供片蚌内壳光泽度与珍珠光泽度呈极显著正相关（ r = 0.717 ~ 0.939 ）,建立供片组内壳光泽度和珍珠光泽度回归方程为：y=16.81+0.93x(R^2=0.777),供片蚌生长性状与珍珠光泽度相关性不显著;不同组育珠蚌培育珍珠的光泽度差异显著,但育珠蚌生长性状和内壳光泽度与珍珠光泽度不存在显著相关性。以上结果说明幼蚌期选育外壳颜色青色的三角帆蚌,达到了提升珍珠光泽度的目标,可作为选育产高光泽度珍珠三角帆蚌的间接性状,供片蚌内壳光泽度与珍珠光泽度显著相关,以其作为目标性状更优。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。     

三角帆蚌所育不同颜色珍珠及其相关组织金属元素种类和含量差异分析

为研究Mn、Mg、Fe、Cu、Zn、Co这6种金属元素对珍珠颜色的影响,选用产自同一养殖池塘的三角帆蚌,比较分析这6种金属元素在内壳色为深紫色、浅紫色和白色的三角帆蚌中分别培育的紫色和白色珍珠中的含量差异,并分析金属元素含量与珍珠L,a,b颜色参数的相关性。结果显示:Mn、Mg、Fe、Co 4种金属元素在深紫色珍珠中均呈现最高含量,在白色珍珠中未检出Fe; Cu除了在三角帆蚌内壳色为浅紫色的珍珠中稍有体现之外,其余组均未检出;Zn在所有颜色珍珠中均未检测出。通过金属元素含量与珍珠颜色参数相关性分析发现,在各颜色育珠蚌组中,所育珍珠的Fe含量均与dE值呈正相关(R~20.83),Mg含量均与L值呈负相关(R~20.80),Mn含量则均与a值呈正相关(R~20.64),仅在深色蚌组中发现,所育珍珠的Co含量与L值的负相关性最高(R~20.94)。进一步比较分析了深紫色、浅紫色和白色三角帆蚌不同部位外套膜以及间液的金属元素含量,深紫色蚌组不同位点外套膜Fe含量存在显著性差异(P0.05),1号位点含量最高;不同壳色蚌的2号位点外套膜Mn、Co含量存在显著性差异(P0.05),其中白色蚌Mn含量显著高于其他两组,深紫色蚌Co含量显著高于其他两组。在白色蚌组的间液中,Mg含量存在显著性差异(P0.05)。综上所述,淡水紫色珍珠的颜色深浅与Fe、Mg、Co、Mn含量存在相关性。     

三角帆蚌IGF2基因的亚细胞定位及重组蛋白促体外细胞活性分析

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factors 2, IGF2)在多种细胞生长、分化和合成代谢的调节中发挥重要的调控作用。本研究成功构建了淡水珍珠贝三角帆蚌IGF2的重组质粒pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2,通过pEGFP-IGF2-细胞转染,表明该蛋白定位在细胞质与细胞核中。将pET32a-IGF2转化到BL21 (DE3)中进行蛋白诱导表达,成功得到其原核表达载体,SDS-PAGE检测显示,在约25kD处有一条清晰的条带,符合目的条带大小（26.27kD）,且主要表达于上清液中。为研究重组蛋白IGF2对三角帆蚌细胞活性的作用,本研究通过CCK8细胞活性测定,进一步探讨了添加不同浓度重组目的蛋白（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、 12.5 μg/mL、17.5 μg/mL、 22.5 μg/mL）培养的三角帆蚌外套膜细胞增殖活性。结果显示,三角帆蚌IGF2重组蛋白能显著促进三角帆蚌外套膜细胞的增殖活力（P＜0.05）,且在其浓度为12.5 μg/mL时对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果最佳,这为促进三角帆蚌外套膜细胞传代、细胞系建立奠定了基础,也为下一步探究IGF2在贝类中的功能提供依据。     

三角帆蚌外套膜细胞培养与组织培养的比较

通过对三角帆蚌外套膜外表皮进行组织培养和细胞培养的比较研究，表明组织培养比细胞培养更易获得大量游离细胞。并且通过原子吸收光谱分析，证明体外培养的三角帆蚌组织和细胞皆能正常分泌珍珠质，且两者的分泌能力大体相同。     

三角帆蚌外套膜细胞培养与组织培养的比较

通过对三角帆蚌外套膜外表皮进行组织培养和细胞培养的比较研究，表明组织培养比细胞培养更易获得大量游离细胞。并且通过原子吸收光谱分析，证明体外培养的三角帆蚌组织和细胞皆能正常分泌珍珠质，且两者的分泌能力大体相同。     

水稻细胞悬浮系及其单细胞培养的研究

以水稻的不同遗传型材料的幼穗为外植体诱导愈伤组织,通过继代培养,最终筛选出了来自于品系“１４５”的胚性愈伤组织．在附加１．５～２．０ｍｇ／ｌ２,４—Ｄ的ＮＭＢ固体培养基上继代７次后,转入同种液体培养基上进行悬浮继代培养,由此形成的悬浮系是由单细胞和小细胞团组成的．倒置显微镜下几乎观察不到管形细胞,细胞的成活率达９０％以上．未发现酵母抽提物对细胞悬浮培养具有促进作用．在液体培养基中附加６００ｍｇ／ｌ的肌醇能够大大提高愈伤组织的分散程度,从中分离出的单细胞经初步培养再生了愈伤组织．     

枸杞胚细胞悬浮培养系统建立的研究

以宁夏农科院选育的新品种宁杞 1号 3年生树为试材 ,对影响枸杞胚细胞悬浮培养及其再生系统建立的培养基与激素配比进行了研究。结果表明 ,以人工授粉后 18d的幼果 ,剖取成熟胚作为外植体 ,选择 MS+6 BA1.0 mg/ L+IBA0 .5 m g/ L 培养基诱导愈伤组织 ,经单细胞悬浮培养建立了稳定的细胞系 ;MS+6 BA0 .2mg/ L 培养基较为适宜枸杞胚状体萌发成苗 ,该再生苗转移到 MS+NAA0 .2 mg/ L 生根培养基上 ,诱导生根并获得完整植株 ;共移栽成活 14株 ,成活率达 38.8%。     

粉拟青霉三级固体培养料的选优

本文记述了粉拟青霉（ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｆａｒｉｎｏｓｕｓ（Ｈｏｉｍ　ｅｔＳ．Ｆ．Ｇｒｏｇ）ＢｒｏｗｎｅｔＳｍｉｔｈ）在五种不同固体培养料上进行三级扩大培养时的培养性状，并根据其产孢量的测定结果，判断以棉子壳和牛粪为主的两类固体培养料为优良培养基，该菌在这两种培养基上培养容易，产孢量大；这两种培养基原料易得，经济实用，易于推广。     

栝楼细胞悬浮系的建立

[目的]为了解决栝楼悬浮细胞系在继代培养中容易退化,生长速度减慢的问题。[方法]以栝楼的茎为外植体诱导出愈伤组织,筛选出质地疏松、生长迅速、易于分散、可以长期进行继代培养的淡黄色半透明状愈伤组织系,将该愈伤组织接种在液体培养基中进行振荡悬浮培养,建立起分散程度好的栝楼悬浮细胞系。同时对影响愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养的条件进行研究,确定适合愈伤组织生长的条件及影响细胞悬浮培养的主要因素。[结果]看护培养可以使栝楼悬浮培养细胞长势良好,并在低密度下获得由单细胞形成的细胞系。[结论]该悬浮系的建立为栝楼细胞大规模培养,进而实现有效药物成分的工业化生产奠定了理论基础。     

大花木绣球组织培养体系

以大花木绣球芽茎段为外植体,研究不同消毒时间、不同类型的芽、不同培养基对大花木绣球增殖和生根的影响。结果表明:采用质量浓度0.1%HgCl_2,消毒时间8 min,对大花木绣球的消毒效果最好;带有顶芽的侧芽萌发率较高,萌发率达到72.5%;适合大花木绣球增殖的培养基为WPM+1.0 mg·L~(-1) IBA+0.75 mg·L~(-1)NAA;大花木绣球最适合的生根培养基为1/4WPM+1.0 mg·L~(-1) NAA。     

小麦幼胚离体培养的研究初报

[目的]筛选适宜小麦幼胚培养的培养基和转基因受体材料的优良基因型,为小麦转化、遗传等提供依据.[方法]以7个春小麦品种(系)的幼胚为材料,取开花后12～16 d的幼胚进行培养,20 d后统计幼胚一步成苗数和愈伤组织绿苗分化数.[结果]小麦幼胚在C17、MS和YP三种培养基上都能诱导一次成苗,其中YP培养基一次成苗率最高(75;),其次是MS(33.13;),最低的是C17(23.34;),YP培养基一次成苗的效果明显优于其它两种培养基,不同基因型间的愈伤组织绿苗分化率差异明显.[结论]筛选出适宜小麦幼胚培养一次成苗的YP培养基和一次成苗和愈伤组织分化绿苗率都较高的材料新春9号,此材料可作为幼胚培养和转基因受体材料的优良基因型.     

半枝莲组织培养技术研究

药用植物半枝莲是一种应用范围广使用量大和药效功能多的传统中药,近年研究表明其还具有良好 的抗肿瘤作用,研究了不同激素及添加量对半枝莲继代培养和生根培养的影响,结果表明院不同的细胞分裂素和生 长素比例对半枝莲继代培养的影响不同半枝莲继代培养最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IAA 0.2 mg/L,不同的细胞分裂素和生长素比例对半枝莲根的生长影响也不同,半枝莲壮苗生根最适培养基为1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L。     

大豆原生质体愈伤组织的体细胞胚胎发生(英文)

在改良MS培养基上从5个大豆品种成熟种子来源的幼苗未展开叶片上诱导出愈伤组织,利用2个月月龄的这些愈伤组织在摇床上建立了细胞悬浮培养系,细胞悬浮培养系每1至2周转培1次,并用于原生质体分离,转培后3到5天的细胞经酶解后原生质体的产量最高,纯化后的原生质体用3种方法进行培养,即液体培养法、琼脂包埋法和琼脂底层法,在琼脂底层法中,培养皿底层先浇上无甘露醇的琼脂培养基,而原生质体则悬浮在2到4毫升含0.45 mol甘露醇的培养基中,3种方法以琼脂底层法最佳,原生质体在培养后2到3天内能见到第1次细胞分裂,在适当的条件下1周内高达80％的原生质体发生分裂,置板频率一般在40％到60％之间,5个供试品种中4个的原生质体愈伤组织在固体和液体培养中出现体细胞胚胎发生,在液体培养条件下得到了大量子叶和胚根发育良好的体细胞胚,但由于这些胚未进一步萌发,故未能得到完整的再生植株。