陆地棉CAD基因家族的进化和表达分析

[目的]对陆地棉CAD基因家族成员进行进化和表达分析,了解其在棉纤维发育中的作用.[方法]应用生物信息学方法,从棉花基因组中筛选出21个CAD基因,并对CAD的基因结构、染色体分布、基因倍增模式以及系统进化进行分析.利用深度表达数据分析CAD基因在棉纤维发育各时期的表达.对比观察拟南芥cad5突变体和野生型根毛表型.[结果]同源性高的CAD基因复制对之间有相似的基因结构;片段重复和串联重复是CAD基因扩增的主要方式.进化分析可知,CAD基因可分为七个亚组,且功能相近的基因聚类在相同亚组.利用深度测序表达数据分析可知,CAD基因在棉纤维各个发育时期均有表达.对比拟南芥cad5突变体和野生型根毛发现,突变体相比于野生型有更长的根毛.[结论]CAD基因参与了棉纤维的发育的过程,并对棉花纤维发育起到一定的调控作用.     

杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式研究

14-3-3蛋白在植物细胞信号传导中发挥重要的作用,探索木本植物14-3-3蛋白家族的进化模式对深入理解该基因家族的功能有重要的指导意义。本文采用生物信息学的方法,在基因组水平上搜索和鉴定了12个杨树14-3-3蛋白基因,其中ε类有7个,非ε类有5个。通过对杨树14-3-3基因家族的系统进化、序列相似性、基因结构和染色体位置分析,发现杨树14-3-3基因的扩张主要是通过最近的一次全基因组加倍事件产生的。在全基因组加倍事件中共产生5对重复基因对,Ka/Ks分析显示这5对重复基因对处于较强的净化选择压力。RT-PCR分析显示在杨树12个14-3-3基因中有8个在不同组织中均表达,另外4个基因的表达部位发生了变异。因此,杨树14-3-3基因家族的分子进化及表达模式的研究结果预示着基因重复后其功能发生了分化。     

南林895杨树GmNHX1基因的转入及其耐盐性分析

将大豆中编码Na＋／H＋离子逆向转运蛋白的GmNHX1基因构建到植物表达载体pGWB402Ω,通过农杆菌侵染叶盘法转化南林895杨树（Populus deltoides xp.euramericana.cn.‘Nanlin895’）,PCR检测和Southern杂交结果表明,Gm NHX1基因已经整合入南林895杨树基因组．对转GmNHX1基因的南林895杨树耐盐性的生理生化指标进行检测,结果表明Gm.NHX1基因的表达能够提高转基因杨树的耐盐性．     

杨树天冬氨酸转氨酶基因家族鉴定及表达分析

[目的]鉴定杨树天冬氨酸转氨酶(ASPAT)基因家族成员,并检测其组织表达特异性,为研究ASPAT在杨树初级氮素同化中的生物学功能提供参考依据.[方法]从杨树基因组数据库中筛选鉴定ASPAT基因家族成员,利用生物信息学软件分析各基因家族成员序列和基因结构及编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和保守基序等,并利用实时荧光定量PCR检测正常施氮处理(1 mmol/L NH4NO3)下其在杨树根、茎和叶中的组织表达特异性.[结果]从杨树基因组中共鉴定出9个ASPAT基因家族成员,包括7个真核型ASPAT(AAT)基因(PtASPAT1~PtASPAT7)和2个原核型AS-PAT(PAT)基因(PtASPAT8~PtASPAT9),编码区(CDS)序列长度1215~1791 bp,编码的氨基酸数目304~480个,外显子数7~14个,编码蛋白的等电点5.66~8.99,相对分子质量33.11~53.31 kD,脂融指数76.36~93.54,分别定位于叶绿体、线粒体和胞质中,除PtASPAT6和PtASPAT7为不稳定蛋白,其他均为稳定蛋白.拟南芥和杨树的ASPAT蛋白可聚为两大类,Ⅰ类为AAT蛋白,包括PtASPAT1~PtASPAT7和AtASPAT1~AtASPAT5;Ⅱ类为PAT蛋白,包括PtASPAT8、PtAS-PAT9和拟南芥PAT(AtPAT).PtASPAT1~PtASPAT6均含有5个保守基序,PtASPAT7缺少2个保守基序,PtASPAT8和PtASPAT9均仅含有1个与AtPAT相同的保守基序.9个杨树ASPAT蛋白均含有磷酸吡哆醛结合位点(SGTHNYSSK)、同源二聚体多肽结合位点(GAVAER)和催化残留活性位点(K).正常氮素处理下,PtASPAT1基因在杨树根、茎和叶中表达量无明显差异;PtASPAT2~PtASPAT9基因在根部的表达量较在茎和叶中的高,尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因表达量较高.[结论]杨树ASPAT基因家族成员主要在根部表达,尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在杨树根部的初级氮素同化中发挥重要作用.     

杨树扩展蛋白基因家族的生物信息学分析

扩展蛋白是植物细胞壁的重要组成部分,广泛存在于植物基因组中,具有疏松细胞壁组分、增加细胞壁柔韧 性的作用,在植物的生长发育及抗性等多个方面起着重要的作用。全基因组序列分析显示,杨树中的扩展蛋白基 因家族包含36 个成员,分属于EXPA、EXPB、EXLB 和EXLA 4 个亚家族。系统生物信息学分析表明,杨树扩展蛋白 基因具有保守的序列特征和稳定的蛋白结构,包括9 种不同的内含子起源模式以及6 个高频密码子。基因表达分 析显示,该家族基因在杨树木材形成相关的组织/ 器官中表达丰度较高,对林木生殖发育也起着重要的作用。研究 结果展示了杨树扩展蛋白基因家族的基本信息和特点,为深入研究杨树扩展蛋白基因的功能搭建平台。      

八角莲肉桂醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

鬼臼毒素是八角莲的重要药效成分。利用同源克隆和RACE的方法,从八角莲的根中克隆了鬼臼毒素生物合成途径肉桂醇脱氢酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因,长1 098 bp,编码由365个残基组成的氨基酸序列。八角莲CAD蛋白不含有质体定位的信号序列,与毛白杨(Populus tomentosa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等物种中CAD蛋白的一致性为67.25%;系统发育分析表明,它与拟南芥的At CAD7、At CAD8和AtCAD6蛋白亲缘关系较近,聚成一个簇。组织表达分析结果表明,八角莲CAD基因在根和茎中有表达,而叶片中表达不明显。本研究获得的CAD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于鬼臼毒素的遗传调控,奠定了基础。     

苦荞FtCAD-1和FtCAD-2基因克隆及组织表达分析

【目的】克隆苦荞肉桂醇脱氢酶（CAD）基因并分析其组织表达特性,为深入研究CAD基因在苦荞果壳形成中的分子调控机制提供理论依据。【方法】基于苦荞转录组测序结果,从苦荞厚果壳品种云荞1号和薄果壳品种小米荞克隆CAD基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CAD基因在不同果壳厚度类型（厚果壳苦荞和薄果壳苦荞）不同组织的表达情况。【结果】从薄果壳苦荞和厚果壳苦荞中均克隆获得2条苦荞CAD基因,且这2条基因序列在薄果壳苦荞与厚果壳苦荞中均完全一致,命名为FtCAD-1和FtCAD-2。FtCAD-1基因的开放阅读框（ORF）长度为876bp,编码291个氨基酸残基,为疏水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞核和细胞质;FtCAD-2基因的ORF长度为1083bp,编码360个氨基酸残基,为亲水性的稳定酸性蛋白,定位于细胞质。FtCAD-1和FtCAD-2蛋白均具有CAD蛋白3个典型的保守结构域,且不具有跨膜结构域和信号肽,属于非分泌蛋白。FtCAD-1与数据库目标蛋白2cf5.1.B的结构相似度为74.74%,而FtCAD-2与数据库目标蛋白5z0c.1.A的结构相似度为63.03%。FtCAD-1与拟南芥的第一类CAD蛋白（AtCAD4和AtCAD5）的亲缘关系较近;FtCAD-2与拟南芥的第二类CAD蛋白（AtCAD2、AtCAD3、AtCAD6等）的亲缘关系较近。FtCAD-1和FtCAD-2基因均在种仁中的相对表达量最高,且厚果壳苦荞与薄果壳苦荞间无显著差异（P>0.05）。FtCAD-1基因在厚果壳苦荞叶、花和果壳中的相对表达量显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01）高于薄果壳苦荞,尤其是在厚果壳苦荞果壳中相对表达量是薄果壳苦荞的16倍。FtCAD-2基因除了在薄果壳苦荞果壳中相对表达量显著高于厚果壳苦荞外,在其他组织中的相对表达量均表现为厚果壳苦荞高于薄果壳苦荞。【结论】FtCAD-1属于第一类CAD基因,具有明显的组织表达特异性,推测其在苦荞木质素生物合成过程中发挥重要调控作用。     

苎麻木质素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表达分析

采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方法对BnCAD基因表达的定量分析结果显示,苎麻CAD基因在湘苎1号和湘苎3号的韧皮部表达水平明显高于其在木质部的表达水平,而在城步青麻木质部的表达水平高于其在韧皮部的表达水平,该基因在湘潭大叶白的韧皮部和木质部表达量接近。4种苎麻茎横切片的木质素染色结果表明,品种间木质素染色度与CAD基因在其韧皮部的表达量成正相关。     

杨树磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对已测序杨树Populus trichocarpa Torr.Gray中磷酸肌醇特异性磷脂酶C(phosphoinositidespecific phospholipase C,PI-PLC)家族基因进行系统分析,利用杨树基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定杨树PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过蛋白序列比对进行进化和分类分析。结果表明,杨树中含有7个PI-PLC家族基因,含有8~10个外显子,分布于杨树的4条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,杨树PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。蛋白质进化树分析结果表明PI-PLC可分为2个亚家族。     

四海集萃

全球合力成功破译杨树基因组序列法国国家农业研究所2004年月宣布,该研究所与来自全球的多个科研小组合作,成功破译了杨树的4万个基因,从而完成了全球第一例树木的基因组排序。据法国国家农业研究所介绍此次破译的是一种名为美洲黑杨(Populus)的杨树品种,之所以选中该树种,是因为其基因组结构紧凑、微小,比松树的基因组要小约50倍,是一种理想的树木实验标本。而且,它具有相当广泛的经济使用价值和环境保护作用。据介绍,该种杨树的基因组包含19对染色体,比4年前人类破译的第一种植物Arabette的多3倍大约有200名来自世界各地的科研人员参与研…     

陆地棉扩展蛋白基因的鉴定与特征分析

目的 扩展蛋白（Expansin）是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。方法 利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。结果 陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种（亚洲棉与雷蒙德氏棉）的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因（2—4个）,具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个（亚）基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai. 005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织（如子叶、新叶、老叶、苞叶）中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。结论 陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。     

小麦PIN基因家族的鉴定及表达分析

【目的】PIN（puroindoline）是植物所特有的一类蛋白家族,对控制小麦籽粒硬度有重要功能。分析小麦PIN家族成员在全基因组的分布、结构及进化,研究其在不同组织的表达特异性以及在不同硬度种子的表达模式,为阐明小麦PIN基因家族的生物学功能奠定基础。【方法】根据已报道的小麦PIN基因和大麦HIN基因,利用BLASTP和HMM方法,在最新发布的小麦中国春参考序列中鉴定小麦PIN基因家族成员。利用UniProt、URGI、PFAM、CDD、expVIP等数据库,采用Clustal X、MEGA 7.0、ExPASy、MEME、GSDS、TB tools、GraphPad Prism5等软件进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法检测TaPIN基因家族在不同籽粒硬度小麦样品中的表达情况。【结果】共鉴定出19个小麦PIN基因,集中成簇分布于第1、5和7染色体同源群,编码148—327个氨基酸,编码蛋白相对分子量为16.39—37.19 kD,等电点为6.35—9.34。通过结构域和系统发育分析,可将19个TaPIN基因分为A和B两大类。大部分TaPINs基因仅有1个外显子,没有内含子,顺式作用元件分析发现其上游序列包含大量抗逆和种子发育相关的调控元件。转录组分析表明该基因家族在小麦籽粒中相对表达量很高,而在根茎叶等其他组织几乎不表达。实时荧光定量PCR表明,各基因间相对表达量差异显著,TaPIN9和TaPIN10表达量较高。随着小麦籽粒硬度降低,TaPIN9和TaPIN10表达上调,且表达比例增加,而TaPIN16和TaPIN6则呈现相反的趋势。【结论】小麦籽粒硬度的调节以Pina和Pinb为主,该基因家族其他成员也具有相同结构域,推测也具有相似功能,但受表达量低的限制,对籽粒硬度影响较小。从该基因的进化关系看,粗山羊草与小麦亲缘关系最近,其次是燕麦、黑麦和大麦。     

基于Cas9/gRNA创制毛果杨COBRA3基因突变体

目的COBRA对植物生长发育具有重要作用，已有的研究表明，植物COBRA基因与其次生生长有关。为探究树木COBRA基因信息及部分基因功能，我们对毛果杨PtrCOBRA基因家族展开识别和分析性研究。方法分析PtrCOBRA家族成员关系时运用系统进化树，确定毛果杨PtrCOBRA家族基因的各组织转录表达时采用半定量RT-PCR，创制PtrCOBRA3基因突变体时使用Cas9/gRNA基因编辑策略，毛果杨遗传转化采用农杆菌介导组培幼苗茎段浸染法。结果我们识别毛果杨基因组上存在14个PtrCOBRA基因成员，进化树显示PtrCOBRA家族分成两个分支。半定量RT-PCR表明，PtrCOBRA3和PtrCOBRA11在毛果杨木质部高丰度、特异地转录表达，在木质化茎节中其转录水平也较高。基于Cas9/gRNA技术我们敲除了毛果杨PtrCOBRA3，获得4株ptrcobra3敲除突变体。ptrcobra3突变体植株表型:植株矮小，叶片细长且卷曲，茎干略有弯曲。结论PtrCOBRA3和PtrCOBRA11是PtrCOBRA家族中与毛果杨次生生长相关的主要成员；基因敲除遗传证据显示PtrCOBRA3基因参与毛果杨茎干次生生长，PtrCOBRA11与它存在功能的冗余。      

胡杨叶与根中特异性表达基因的表达谱分析

以2年生胡杨实生苗为研究材料,通过NaCl溶液处理24 h,分别收集NaCl处理后的细嫩白根及叶片,采用CTAB法抽提胡杨盐胁迫下的叶与根的RNA,用基因芯片技术研究胡杨盐胁迫后叶与根中基因的差异表达。经过比对,差异10倍以上的基因共有175个,其中在叶中表达上调的有120个,在根中表达上调的有55个。     

杜仲肉桂醇脱氢酶基因全长cDNA克隆及序列分析

以杜仲(Eucommia ulmoides Olive)4、5月份新长成的杜仲幼嫩叶片为材料,在克隆一段肉桂醇脱氢酶(cin-namyl alcohol dehydrogenase,CAD)基因的基础上,以杜仲cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增法(Rapid ampli-fication of cDNA Ends,RACE)克隆了5’端828 bp和3’端798 bp cDNA序列,经5’RACE产物和3’RACE产物序列拼接,获得全长为1243bp的杜仲CAD cDNA序列,开放阅读框编码243个氨基酸,命名为EuCAD(GenBank登录号:DQ142643)。与GenBank中序列比对分析发现,该cDNA序列与苹果树、桉树、红橡树中的CAD基因序列同源性均为81%,预测编码的氨基酸序列与苹果树、桉树、红橡树的同源性分别为73%、70%和70%,因此认为是杜仲肉桂醇脱氢酶基因。该基因为首次从杜仲中克隆,为探索木质素的合成调控机理奠定基础。     

水稻DnaJ蛋白的生物信息学分析

DnaJ蛋白是一类很大的蛋白家族,因含有保守的DnaJ结构域而得名。本文对水稻DnaJ蛋白进行了生物信息学分析表明,水稻中共有101个DnaJ蛋白,分为典型的三大类。通过表达证据搜索发现,除了11个基因没有表达证据外,其他基因在水稻中都有表达。此外,对水稻的DnaJ蛋白家族进行了初步的进化分析。     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.