葡萄糖醛酸木聚糖生物合成研究进展(综述)

【目的】细胞壁在植物形态结构维持、生长发育和抗病虫害等方面起重要作用,有些细胞壁还可以作为食用或药用材料.近年来植物细胞壁更是作为重要的生物质资源和生物原材料,成为植物学研究的一个热点.作为细胞壁重要成分之一的木聚糖更是在这十年间取得了突破性进展,有必要对其进行总结.【方法】通过查阅相关文献,并结合笔者的研究,归纳总结葡萄糖醛酸木聚糖生物合成的研究进展.【结果和结论】葡萄糖醛酸木聚糖为植物次生壁最主要的半纤维素组分,其合成需要多种糖基转移酶参与.模式植物拟南芥中葡萄糖醛酸木聚糖合成相关基因的突变会导致不规则木质部导管坍塌和木纤维细胞壁变薄等.通过这些拟南芥突变体的表型分析和基因功能研究,鉴定了多个与葡萄糖醛酸木聚糖的主链、四糖末端和侧链合成有关的基因,对这些基因的整体分析有利于更加充分地了解葡萄糖醛酸木聚糖的合成途径.该文对参与葡萄糖醛酸木聚糖合成的相关基因进行了综述,对葡萄糖醛酸合成中的一些不确定问题进行了探讨,并展望了一些葡萄糖醛酸木聚糖将来的研究重点.     

小麦热胁迫响应基因TaMYB165的克隆与功能分析

【目的】MYB转录因子在植物生长发育和抗逆过程中起着重要作用,克隆小麦MYB基因并对其功能进行研究,对植物MYB转录因子的调控机制具有重要意义。【方法】利用Affymetrix小麦芯片系统,分析2个小麦品种中国春(热敏感)和TAM107(耐热)在不同热胁迫处理下的转录谱,从热胁迫上调表达的EST序列中克隆得到小麦耐热相关TaMYB165基因,并对该基因的表达特性及功能进行研究;利用实时定量RT-PCR技术分析小麦不同发育时期、不同组织器官热胁迫处理下TaMYB165基因的动态表达模式,构建超表达载体并转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥株系进行耐热性鉴定。【结果】克隆获得1个小麦MYB转录因子家族基因TaMYB165,该基因ORF长度为847 bp,编码282个氨基酸。同源序列分析表明,TaMYB165与高粱SORBIDRAFT 03g040120亲缘关系最近(73.2%),与水稻MYB蛋白和拟南芥AtMYB165的相似性分别为70.37%和33.0%。qRT-PCR结果显示,TaMYB165在小麦苗期和灌浆期都受热胁迫诱导表达,只是响应的早晚有所不同。在拟南芥中过量表达TaMYB165,转基因株系热胁迫后成活率提高,细胞膜热稳定性增强。【结论】TaMYB165是小麦热胁迫响应的重要转录因子,可作为小麦耐热育种的重要候选基因。     

2022 年 11 期目录

  目的  次生细胞壁的发育对于木材的形成至关重要,揭示林木次生壁形成的分子调控机制将为改良其木材品质提供理论依据。  方法  （1）本研究从速生型杨树NE19中克隆得到PdKNAT7基因,并构建表达载体,采用花序侵染法转化拟南芥,筛选得到过表达植株。（2）利用农杆菌介导的瞬时转化法侵染烟草,对PdKNAT7进行亚细胞定位。（3）通过徒手切片观察不同基因型拟南芥花薹基部的次生细胞壁厚度。（4）通过真空渗透的方法瞬时转化84K杨。（5）qRT-PCR分析不同品系杨树中PdKNAT7基因的表达情况,并揭示拟南芥和杨树中参与次生壁形成的相关基因的表达模式。  结果  （1）PdKNAT7定位于细胞核。（2）PdKNAT7主要在NE19杨茎中表达,且表达量高于107杨。（3）与野生型相比,过表达PdKNAT7的拟南芥花薹基部的束间纤维壁变薄,木质部纤维壁变厚,而突变体正好相反;另外,突变体的导管壁更厚。（4）过表达PdKNAT7的拟南芥植株中,4CL1、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量均下调,突变体中与之相反。（5）瞬时转化PdKNAT7基因的84K杨中,4CL3、C4H1、CCR1、CesA8、IRX9和IRX10基因的表达量也下调。  结论  PdKNAT7通过调控木质素和纤维素的积累来影响拟南芥次生细胞壁的厚度。      

芍药PlFLS基因生物信息学分析及对拟南芥的遗传转化

【目的】探讨类黄酮合成途径关键基因黄酮醇合酶基因(FLS)在芍药Paeonia lactiflora花色调控中的作用。【方法】克隆获得芍药Pl FLS基因,对其进行生物信息学分析,构建Pl FLS基因的过表达载体,通过农杆菌介导的Floral-dip法进行拟南芥遗传转化研究。【结果】生物信息学分析表明,芍药Pl FLS基因氨基酸序列与茶树相似性较高,存在2个功能结构域,但不存在信号肽位点。芍药Pl FLS蛋白预测模型揭示了其蛋白三级结构中存在1个2–氧代戊二酸配体,并与多条肽链相连接。试验成功获得了转Pl FLS基因纯合拟南芥植株,GUS染色和PCR鉴定证实了目的基因已经整合转基因植株基因组,q RT-PCR分析显示,相对于野生型,Pl FLS基因在遗传转化植株中显著高表达(P0.05)。色谱分析结果显示,转Pl FLS基因拟南芥植株叶片中花黄素含量显著增加(P0.05)。【结论】成功构建转Pl FLS基因拟南芥,并证明Pl FLS基因可以显著影响拟南芥类黄酮合成途径。     

小麦转录因子基因TaWRKY33的耐盐性分析

【目的】WRKY转录因子是植物转录调节因子家族之一,参与调控植物病原菌的防御、生长发育和抗逆应答等多种生理过程。小麦WRKY转录因子基因TaWRKY33可以提高转基因拟南芥对干旱和高温的抗性。通过分析TaWRKY33的耐盐性,检测TaWRKY33转录因子的转录活性,深入分析转录因子基因TaWRKY33的功能,以解析其耐盐调控机制。【方法】以盐胁迫处理的小麦cDNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测TaWRKY33在盐胁迫条件下的表达模式;将TaWRKY33的CDS序列插入带有CaMV35S启动子的pCAMBIA1302表达载体中,构建表达载体pCAMBIA1302-TaWRKY33,转入农杆菌,侵染野生型拟南芥获得转基因株系;同时利用pWMB110-TaWRKY33双元载体创建了过表达小麦株系。用转TaWRKY33的拟南芥和小麦进行耐盐性鉴定。构建诱饵载体pGBKT7-TaWRKY33,通过单转法将诱饵载体pGBKT7-TaWRKY33重组质粒和文库质粒逐步转化到酵母AH109感受态细胞。通过SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal显蓝反应筛选得到阳性克隆,进行测序和BLAST分析。制备小麦原生质体,通过瞬时表达试验共转化报告子和效应子质粒,计算相对荧光值分析转录因子的转录活性。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,TaWRKY33受盐胁迫的诱导表达。双荧光素酶瞬时表达试验表明TaWRKY33在小麦细胞中可以激活相应荧光素酶的活性。从功能分析,在正常生长条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥没有明显差异;在盐处理条件下,转基因拟南芥的根长大于野生型拟南芥的根长;过表达拟南芥的鲜重大于野生型,呈显著性差异。重要的是,在盐处理下,鲜重、相对电导率和Na+含量表明,过表达TaWRKY33的小麦较其受体对照有更好的耐盐性。对TaWRKY33候选互作蛋白分析表明,这些候选互作蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaWRKY33在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。【结论】小麦TaWRKY33受盐胁迫的诱导表达,具有潜在的转录激活活性,提高了转基因拟南芥和小麦的耐盐性;TaWRKY33可能需要其他蛋白共同作用提高小麦耐盐性。     

葡萄糖醛酸木聚糖生物合成研究进展

【目的】细胞壁在植物形态结构维持、生长发育和抗病虫害等方面起重要作用,有些细胞壁还可以作为食用或药用材料.近年来植物细胞壁更是作为重要的生物质资源和生物原材料,成为植物学研究的一个热点.作为细胞壁重要成分之一的木聚糖更是在这十年间取得了突破性进展,有必要对其进行总结.【方法】通过查阅相关文献,并结合笔者的研究,归纳总结葡萄糖醛酸木聚糖生物合成的研究进展.【结果和结论】葡萄糖醛酸木聚糖为植物次生壁最主要的半纤维素组分,其合成需要多种糖基转移酶参与.模式植物拟南芥中葡萄糖醛酸木聚糖合成相关基因的突变会导致不规则木质部导管坍塌和木纤维细胞壁变薄等.通过这些拟南芥突变体的表型分析和基因功能研究,鉴定了多个与葡萄糖醛酸木聚糖的主链、四糖末端和侧链合成有关的基因,对这些基因的整体分析有利于更加充分地了解葡萄糖醛酸木聚糖的合成途径.该文对参与葡萄糖醛酸木聚糖合成的相关基因进行了综述,对葡萄糖醛酸合成中的一些不确定问题进行了探讨,并展望了一些葡萄糖醛酸木聚糖将来的研究重点.     

拟南芥抗寒基因ICE1的克隆及功能分析

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进化树表明,拟南芥ICE1基因与其他物种的ICE1基因差别较大。用农杆菌介导法得到4株阳性烟草植株,Southern blotting检测证明,ICE1基因已经以单拷贝的形式整合到烟草基因组中。实时荧光定量PCR检测表明,ICE1基因在转基因烟草植株的根、茎和叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量最高。4℃低温环境下,与未转化植株相比,转ICE1基因烟草植株叶片的相对电导率降低了12.00%~17.65%,脯氨酸含量增加了13.28%~24.10%,丙二醛含量减少了7.09%~14.52%,过氧化物酶活性提高了9.39%~22.54%。【结论】克隆获得了拟南芥ICE1基因的完整开放阅读框序列,在烟草中转入ICE1基因可提高其耐寒性。     

IRX3基因在秦川牛不同组织中的表达分析

【目的】研究IRX3(Iroquois homeobox 3)基因在秦川牛各组织中的表达规律,为通过现代分子技术手段改良秦川牛肉用性状提供理论依据。【方法】根据秦川牛IRX3的mRNA序列设计实时定量特异性引物,采用实时荧光定量PCR方法,检测IRX3基因在秦川牛不同生长发育阶段(胎儿、6月龄、24月龄)不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉(背最长肌))及在6月龄、18月龄、24月龄、60月龄秦川牛脂肪组织中的表达水平。【结果】IRX3基因在秦川牛胎牛、6月龄、24月龄3个阶段均在肺部组织中表达量最高(P0.01)。IRX3基因在秦川牛心脏、肝脏中的表达量随年龄的增长而极显著增加(P0.01);在背最长肌中的表达量随生长发育过程的推进而极显著减少(P0.01);在大肠、肺脏组织中的表达量从胎牛到6月龄逐渐降低,从6月龄到24月龄极显著增加(P0.01)。随着年龄的增长,秦川牛脂肪组织中IRX3基因的表达量呈先升高后降低最后再升高的变化趋势,18月龄表达量最高,极显著高于其他年龄段(P0.01);其次是6月龄,表达量极显著高于24~60月龄(P0.01)。【结论】IRX3基因在不同阶段秦川牛的肺部组织中均有较高水平的表达;IRX3基因在脂肪组织中的表达量与牛生长速度正相关,推测IRX3基因在秦川牛发育过程中与脂肪沉积有密切联系。     

Ac-MNPV lef-10在Sf9细胞中的表达与定位研究

【目的】研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10在宿主细胞Sf9中的时空表达及定位,为进一步研究lef-10的功能提供理论基础。【方法】利用不同的特异引物,通过PCR方法扩增lef-10及innateP-lef-10目的片段,将目的片段分别克隆到载体pTriEx-SP-GFP上,得到重组质粒pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP,经过双酶切检测构建载体。将重组质粒分别与Bacmid共转染Sf9细胞,用得到的重组病毒分别于4,8,16,24,36h再次感染宿主细胞;用激光共聚焦显微镜观察lef-10的表达及亚细胞定位情况。【结果】在感染早期,lef-10就已开始表达;随感染时间的推移,lef-10逐渐移动至细胞核,且在晚期和极晚期时相,lef-10主要集中于细胞核中。【结论】在天然条件下,lef-10是作为晩期表达因子发挥功能的,并且对其他基因的转录可能起一定的调控作用。     

根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

苦荞全生育期芦丁积累与其生物合成途径相关基因表达分析

【目的】探究苦荞全生育期芦丁含量变化与其合成途径关键酶基因和调控因子MYB基因表达量之间的相关性,以期进一步明确苦荞植株体内芦丁生物合成的分子机制。【方法】以九江苦荞为试验材料,整个生育期分别在萌发期、子叶期、真叶期、盛叶期、现蕾期、盛花期、灌浆期和籽粒成熟期共8个时期取材(S1—S8)。采用RT-PCR方法,克隆获得与黄酮类代谢相关的MYB类转录因子基因。采用T-coffee软件进行氨基酸同源序列比对及保守结构域分析。与拟南芥黄酮类代谢相关的MYB转录因子及荞麦同源MYB转录因子序列比对,基于邻近法构建系统进化树;实时荧光定量PCR技术分析芦丁合成途径中5个关键酶Ft CHS、Ft F3H、Ft4CL、Ft FLS-like和Ft UFGT及上述克隆到的MYB转录因子在不同组织中的表达模式。基于高效液相色谱法(HPLC)测定全生育期取材组织的芦丁含量。同时采用相关性分析方法分析不同组织中芦丁含量变化与基因表达模式的相关性。转换上述数据为矩阵,采用欧式距离法构建共表达层次聚类图谱。【结果】克隆到2个MYB类转录因子,即Ft MYB7和Ft MYB9,其核酸序列长度分别为876和912 bp,分别编码291和303个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比对分析结果表明,二者均具有典型的R2R3保守结构域,为R2R3类型的MYB转录因子。结合Nr数据库中17个苦荞和3个拟南芥黄酮类代谢相关MYB转录因子同源氨基酸序列构建系统进化树,结果表明这22个基因分成6大类群,其中Ft MYB7属于第II类群,Ft MYB9属于第IV类群,二者分属于不同类群,暗示这2个MYB转录因子可能涉及调控植物生长发育过程中不同功能类型。荧光定量结果显示,Ft MYB7在S3(真叶期)和S5(现蕾期)基因相对表达量最高,达到501和867倍;Ft MYB9在S1(萌发期)和S2(子叶期)相对表达量最高,分别为34和72倍。上述基因表达量与芦丁含量变化模式相关性分析表明,8个生长时期中,Ft4CL、Ft CHS、Ft F3H、Ft UFGT和Ft MYB7相对表达模式与芦丁含量变化幅度呈正相关,其相关系数分别为0.748、0.683、0.704、0.890和0.862。而Ft FLS-like和Ft MYB9与芦丁含量的变化幅度呈负相关,其相关系数分别为-0.442和-0.501。【结论】Ft MYB7和Ft MYB9转录因子在整个生育时期中表达模式存在明显差异。其中Ft MYB7可能在苦荞芦丁积累的过程中起到正调控作用,而Ft MYB9则为负调控作用。     

拟南芥热激转录因子AtHsfA6a的克隆与细胞定位分析

【目的】研究拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在植物细胞中的定位及其作用机制。【方法】用RT-PCR方法从野生型拟南芥总RNA中,扩增获得了849 bp的拟南芥热激转录因子AtHsfA6acDNA片段,经过测序,结果与公布的序列完全相同。将该片段与绿色荧光蛋白(GFP)基因的cDNA重组,并克隆到表达载体pCHF3上,经PCR与酶切检测表明构建的表达载体正确。按照Clough等的方法转化拟南芥,经Kanamycin筛选和PCR检测,得到转基因植株;用激光共聚焦扫描荧光显微镜观察转基因植株幼苗的根部。【结果】在正常条件下,融合蛋白存在于细胞质中。【结论】在正常条件下拟南芥热激转录因子AtHsfA6a在细胞质中表达。     

拟南芥xtc1突变体的图位克隆分析

【目的】分析拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡的组分和含量,并鉴定导致xtc1突变体表型的基因。【方法】通过气相色谱法分析拟南芥xtc1突变体与Ler野生型茎部表皮蜡的成分;利用图位克隆确定突变基因位点,通过在拟南芥xtc1突变体中过量表达FATB基因,验证突变位点与FATB基因的关系。【结果】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡总量约为Ler野生型的1/3,且各组分含量均明显减少;将突变基因定位在第1染色体顶端物理距离为80kb的2个标记T27G7-3和F22O13-1之间,该区域含有21个基因。T-DNA插入突变体观察及测序分析表明,xtc1突变体在At1g08510(FATB)基因的第1个外显子上产生14个碱基的缺失,导致翻译提前终止;在xtc1突变体中过量表达FATB基因可恢复xtc1突变体的正常表型。【结论】拟南芥xtc1突变体茎部表皮蜡含量减少,且突变基因为FATB基因。     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

洋葱AcSCL4的克隆及其功能分析

【目的】初步探讨AcSCL4在洋葱成花中的功能，为解析洋葱成花分子调控机制提供理论基础。【方法】以长日生态型洋葱品系SB2为试验材料，根据已有的洋葱转录组数据，通过qRT-PCR筛选目的基因AcSCL4后进行基因克隆，并对其进行生物信息学分析；构建AcSCL4基因的过表达载体pB221-3300-AcSCL4并转化农杆菌，采用花序浸染法浸染拟南芥，并对T₃代纯系转基因植株进行表型分析和开花相关基因表达量分析。【结果】洋葱AcSCL4基因CDS长1 515 bp，编码504个氨基酸；AcSCL4蛋白N端高度变异，C端有GRAS结构域。聚类分析发现，AcSCL4与石刁柏和棉花的SCL4蛋白亲缘关系较近。与野生型拟南芥相比，AcSCL4过表达植株表现晚花表型。荧光定量PCR结果表明，与野生型拟南芥相比,AcSCL4过表达植株开花调控基因CO和FT的表达量极显著下降。【结论】AcSCL4通过调控CO及FT基因表达来抑制洋葱开花。     

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体,获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系,并在正常生长条件下,比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化,分析了可能的分子机制。【结果】结果表明,正常生长条件下,转基因植株与野生型相比表现出萌发,幼苗生长以及开花阶段的生长抑制;气孔开度减小,叶片内源ABA含量降低;ABA信号传导基因表达增强,而ABA合成基因表达降低;而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应,抑制植株的生长发育。因此,在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。     

红花油体表达人透明质酸酶基因的初步研究

【目的】获得转人源透明质酸酶基因PH20(hPH20)红花,为hPH20药用蛋白的生产奠定基础。【方法】人工合成hPH20基因,并在两端引入NcoⅠ/HindⅢ酶切位点。将合成的hPH20基因与pUC57载体连接,构建克隆载体pUC57-hPH20,对其进行双酶切鉴定。用NcoⅠ/HindⅢ酶切pUC57-hPH20获得hPH20基因,将其插入到植物油体高效表达载体pOBT上,构建重组质粒pOBT-hPH20,进行PCR和双酶切鉴定。采用冻融法将重组质粒pOBT-hPH20转入根瘤农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化红花,对转hPH20基因红花植株进行PCR检测。【结果】成功构建了hPH20基因的植物油体表达载体pOBT-hPH20,获得了3株PCR检测呈阳性的转hPH20基因红花植株。【结论】建立了完善的红花再生体系,获得了转hPH20基因的红花植株。     

山楂中木质素合成调控转录因子MYB46的克隆及功能鉴定

模式植物拟南芥AtMYB46在次生壁形成过程中充当纤维素、木质素和木聚糖生物合成基因的转录调节因子,其表达受植物特异性转录因子NAC家族成员的调控。然而,果树次生壁生物合成的调节机制在很大程度上尚不清楚。从山楂(Crataegus pinnatifida)中分离克隆得到与拟南芥和苹果中MYB46具有高度保守R2R3 MYB DNA结合结构域的MYB46编码基因,并将其命名为CpMYB46。通过农杆菌介导的转化方法分别在拟南芥、烟草和苹果中异位表达CpMYB46基因。异位表达CpMYB46基因的拟南芥和烟草的次生壁过量沉积而导致生长受到限制,表现出株型矮小和叶片上卷的表型。定量RT-PCR数据表明,CpMYB46基因可以调控转基因植株次生细胞壁生物合成中下游基因的表达,茎切片观察表明异位表达CpMYB46明显增加了转基因拟南芥、烟草和苹果木质部中次生壁厚度。EMSA实验结果表明其上游NAC家族成员CpSND1可以直接结合CpMYB46基因的启动子。研究揭示了CpMYB46在DNA结合结构域与拟南芥和苹果中的MYB46具有高度保守性,而且在植物次生壁合成调控中也存在功能保守性。研究为揭示山楂内种皮中木质素的合成提供了分子依据,也为山楂的分子育种奠定了基础。     

牛MYOZ1基因启动子活性分析

【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。     

谷子转录因子SiNAC18通过ABA信号途径正向调控干旱条件下的种子萌发

【目的】谷子(Setaria italica L.)具有显著耐旱性。研究旨在通过反向遗传学方法分析并鉴定在干旱条件下影响植物萌发过程的重要调控因子,为研究作物干旱条件下种子萌发的调控机制创造条件。【方法】使用Clustal X 2.0和MEGA 5.05软件对谷子SiNAC18蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建系统进化树;利用real-time PCR方法检测SiNAC18在不同胁迫条件下的表达模式;通过瞬时转化的方法分析SiNAC18蛋白亚细胞定位;在拟南芥中过表达SiNAC18,分析SiNAC18的生物学功能;分析SiNAC18在转基因拟南芥中可能控制的下游基因。【结果】SiNAC18全长1 074 bp,编码由357个氨基酸组成的亲水性蛋白,分子量约为38.8 k D;系统进化树分析表明SiNAC18属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,与拟南芥基因At NAC29同源性最高;氨基酸序列比对结果显示,SiNAC18与其他物种包括水稻、拟南芥、大豆和玉米中同源性最高的NAC类转录因子蛋白的N端都具有A、B、C、D和E这5个保守结构域,蛋白C端具有高度多态性,证明SiNAC18的N端序列与其结合下游基因启动子元件相关;real-time PCR结果显示,SiNAC18在干旱(PEG)、ABA、高盐(Na Cl)及过氧化氢(H2O2)处理条件下的表达量明显上升;亚细胞定位结果表明SiNAC18蛋白定位于细胞核中;基因功能分析结果显示,在ABA和PEG胁迫处理下,SiNAC18转基因拟南芥与野生型种子的萌发率存在明显差异:在正常生长条件下,野生型拟南芥WT和SiNAC18转基因拟南芥的萌发率基本一致,在PEG浓度为10%和15%的MS培养基上,SiNAC18转基因拟南芥的萌发率显著高于WT。在2和5μmol·L-1 ABA处理条件下,转基因拟南芥的萌发率显著低于WT;下游基因表达分析结果显示,ABA信号途径相关基因At RD29A,脯氨酸合成相关基因At P5CR和At PRODH以及过氧化物酶基因At PRX34在SiNAC18转基因株系中的表达量高于WT中的表达量,表明SiNAC18通过调控这些下游基因影响转基因植物在干旱条件下的萌发率。【结论】谷子NAC类转录因子基因SiNAC18可能通过ABA信号途径、氧化胁迫调控等途径正向调控植物在干旱条件下的萌发过程。