TCZB培养液提高小鼠早期胚胎热耐受性的研究

【目的】研究改良的CZB培养液(TCZB)对小鼠早期胚胎发育的影响,寻找一种可以提高动物胚胎热耐受性的新型培养液。【方法】利用原核表达的方法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体—Tat-Hsp70,通过在CZB培养液中添加Tat-Hsp70蛋白,配制成TCZB培养液。比较热应激组及对照组胚胎发育率和囊胚孵出率的不同。【结果】小鼠胚胎经39℃热应激处理后,CZB组、TCZB组及对照组的囊胚发育率及囊胚孵出率无显著差异。41℃热应激处理后各组则有显著差异,对照组囊胚发育率及囊胚孵出率(83.7±6.1和75.6±4.5)显著高于TCZB组(81.3±4.5和76.5±7.6)(P0.05),TCZB组显著高于CZB组(80.2±5.4和73.4±6.2)(P0.05)。【结论】TCZB培养液可以提高小鼠早期胚胎在41℃强烈热应激条件下的发育率,提高小鼠胚胎的热耐受性。     

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【目的】研究改良的CZB培养液(TCZB)对小鼠早期胚胎发育的影响,寻找一种可以提高动物胚胎热耐受性的新型培养液。【方法】利用原核表达的方法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体-Tat-Hsp70,通过在CZB培养液中添加Tat-Hsp70蛋白,配制成TCZB培养液。比较热应激组及对照组胚胎发育率和囊胚孵出率的不同。【结果】小鼠胚胎经39℃热应激处理后,CZB组、TCZB组及对照组的囊胚发育率及囊胚孵出率无显著差异。41℃热应激处理后各组则有显著差异,对照组囊胚发育率及囊胚孵出率(83.7±6.1和75.6±4.5)显著高于TCZB组（81.3±4.5和76.5±7.6）（P＜0.05）,TCZB组显著高于CZB组（80.2±5.4和73.4±6.2）（P＜0.05）。【结论】TCZB培养液可以提高小鼠早期胚胎在41℃强烈热应激条件下的发育率,提高小鼠胚胎的热耐受性。     

激素对小鼠胚胎体外发育的影响

探讨小鼠胚胎体外发育过程中,2种激素(孕马血清促性腺激素PMSG、人绒毛膜促性腺激素HCG)对早期胚胎发育的影响。取原核期胚胎培养于不同的培养体系中,确定适合胚胎发育的最佳体外培养体系;在胚胎培养液中加入不同浓度的激素,观察激素对体外发育的影响。试验发现含10%胎牛血清的人输卵管液培养液(HTF)是该试验条件下小鼠早期胚胎发育的最佳培养液;在该培养液中添加不同浓度和不同种类的激素后,各发育阶段胚胎的发育率与未添加激素的对照组相比均有所下降,但未发现浓度依赖性。由此可认为,高浓度的PMSG和HCG对体外培养的胚胎发育有抑制作用,可降低胚胎发育到各阶段的比例,尤其是显著降低了囊胚的发生率。     

不同换液程序对山羊胚胎发育的影响

通过优化培养程序,筛选培养液,以建立适合山羊胚胎体外发育的培养体系(in vitroculture of embryos,IVC)。培养液添加不同成分和不同换液程序的研究表明,在山羊胚胎培养中,基础培养液选用合成输卵管液(synthesized oviductal fluid,SOF)添加牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(FCS),并采用正确换液程序,即48 h前是SOF+BSA,之后换为SOF+FCS,可获得理想的囊胚率和卵裂率。     

不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响

在TYH受精液中添加促卵泡素（FSH）和苯甲酸雌二醇（E2），检测不同浓度的FSH和E2对昆明小鼠的体外受精率的影响；检测在M16、CZB两种培养液中添加胎牛血清（FCS）与否对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响．结果表明：在．rYH中添加1．0IU／mL FSH，受精率和2-细胞胚率显著高于对照组；在TYH中添加0．1μg／mL E2，受精率和2-细胞胚率也显著高于对照组．在CZB中添加体积分数为10％FCS，可显著减少2一细胞期体外发育阻断，并显著提高小鼠胚胎体外发育的囊胚率，可见，以TYH添加1．0IU／mL FSH和0．1μg／mL E2为受精液，以含体积分数为10％FCS的CZB为胚胎培养液，小鼠胚胎可获得较高的囊胚率．葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的．     

小鼠孤雌胚胎体外共培养体系的建立

[目的]在输卵管上皮细胞和/或垂体细胞饲养层下培养小鼠孤雌胚胎,探讨促进小鼠孤雌胚发育突破2-cell阻滞的机制,建立完善的培养体系。[方法]复式激活小鼠卵母细胞后分别在不同饲养层的CZB培养液中进行培养,并观察、比较各培养条件下孤雌胚胎的发育情况。[结果]培养至24 h,各组无显著差异,都有较高卵裂率。培养至48 h,2类饲养层细胞下的孤雌胚胎48-cell发育效果好,与单独一类饲养层细胞培养差异显著,与对照组比较差异极显著。培养至96 h,2类饲养层细胞下有49.4%（42/85）孤雌胚胎发育为桑囊胚,与其他各组比较差异极显著。[结论]含有输卵管上皮细胞＋垂体细胞的CZB培养液可有效促进小鼠孤雌胚胎发育突破2-cell阻滞,并进一步提高其发育率。     

培养液中血清或其替代物对牛体外受精卵体外发育的影响

探讨在牛体外受精卵体外培养液中添加血清替代品对体外受精卵发育的影响,确定血清在SOF培养液中合适的添加浓度及添加时期,以筛选优良的牛体外受精卵体外培养液.在SOF液中分别添加10%血清(NBS)、8 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和1 mg/ml聚乙烯醇(PVA)进行牛体外受精卵的全程培养,添加NBS组的卵裂率(66.3%)显著高于添加BSA组(51.0%)(P＜0.05),极显著高于添加PVA组(47.6%)(P＜0.01);添加NBS组的囊胚发育率(30.9%)显著高于添加PVA组(20.7%)(P＜0.05),极显著高于添加BSA组(13.6%)(P＜0.01).在培养液中添加不同浓度(10%、5%)的NBS及无血清培养液全程培养时,3组之间卵裂率(65.6%、60.0%、58.0%)差异不显著(P＞0.05);10%NBS组囊胚发育率(30.0%)极显著高于5%NBS组(17.6%)和无血清组(6.0%)(P＜0.01).5%NBS组的囊胚发育率极显著地高于无血清组(P＜0.01).在受精卵培养的最初48 h用5%NBS,之后用10%NBS培养液时,卵裂率(58.6%)和囊胚发育率(29.3%)与SOF+10%NBS全程培养组(66.3%、30.9%)差异都不显著(P＞0.05).试验结果表明,SOF培养液中添加PVA、BSA替代血清时卵裂率和囊胚发育率都明显下降,可能SOF培养液中添加血清比添加PVA或BSA更有利于牛体外受精卵的体外发育.体外培养时在SOF培养液中添加一定浓度的血清以及改变血清的添加方式,可提高牛体外受精卵体外发育效果.     

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。     

序贯共培养体系对小鼠早期胚胎体外发育效果的影响

将体外分离培养经超排处理的新西兰大白兔输卵管上皮及子宫内膜细胞接种于4孔板培养。处理1以CZB为培养液;处理2以CZB加输卵管上皮细胞为培养体系;处理3以CZB加子宫内膜细胞为培养体系;处理4以CZB为培养液,胚胎培养的前24h在输卵管上皮细胞共培养体系中,之后则转入子宫内膜细胞共培养体系中培养(处理4为序贯共培养体系)。将2-细胞期小鼠胚胎随机分配给4个处理,统计各处理组小鼠胚胎的各期发育率及发育质量。结果表明,序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组(P<0.05);囊胚孵化率及孵化囊胚的贴附率显著高于其他共培养组(P<0.05);囊胚细胞总数各共培养组显著高于单独培养液组(P<0.05)。可见序贯共培养体系较单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎的发育率和发育质量。     

HA对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的研究

在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P<0.05),表明HA在卵母细胞无血清成熟培养中可代替BSA。在受精卵体外培养液(TCM-199-c)中添加HA时,囊胚发育率与对照组(BSA)差异不显著(P>0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-c组(P<0.05),表明HA对牛胚胎体外发育具有明显的促进作用,在无血清培养中可以代替BSA。当在TCM-199-c+HA中添加少量的BSA时,囊胚发育率(31.19%)显著高于其他各组(P<0.05),表明HA欲完全代替BSA还有不完善之处,有待进一步研究。     

山羊半胚体外培养试验

研究了培养基、血清浓度和培养温度对山羊半胚体外发育的影响。结果表明:与杜氏磷酸缓冲液和TCM—199相比,在改良Whitten氏液中进行体外培养可显著提高半胚体外发育率(P<0.05);用改良Whitten氏液进行体外培养,含10％和15％犊牛血清组的半胚发育率显著高于5％血清组(P<0.05),极显著地高于无犊牛血清组(P<0.01);在38～39℃的条件下培养半胚的效果显著优于36℃(P<0.05),但在37～39℃的范围内,温度对半胚体外发育率无显著影响(P>0.05)。     

血清饥饿法同步化牛卵巢颗粒细胞周期的研究

研究了体细胞制备过程中细胞培养时间、血清饥饿浓度和饥饿对间对体细胞周期同步化的影响.体细胞为牛卵巢颗粒细胞,细胞用碘化丙啶(PI)染色法,用流式细胞仪检测细胞周期.细胞传代培养至第2、10和25代,在0.5％和0.05％的血清饥饿浓度下诱导处理2、3、4和5d.试验结果表明,第2、10和25代的细胞在G0/G1期的比例没有差异(P＞0.05).培养液中添加0.5％ FCS和0.05％ FCS较对照组(10％FCS)提高了细胞G0/G1期的比例(P＜0.05),0.5％FCS和0.05％ FCS试验组获得了相近的细胞G0/G1期比例(P＞0.05).血清饥饿至第5天的细胞较第2天的细胞有高的G0/G1期的比例(P＜0.05).结果显示,体外培养至不同代的牛卵巢颗粒细胞对G0/G1期的比例没有影响,血清饥饿和延长血清饥饿的时间能够有效诱导体细胞进入G0/G1期.     

小鼠超数排卵与早期胚胎体外培养效果研究

为探讨冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响,分别采用子宫切碎法与子宫冲胚法对超排小鼠进行了冲胚。结果表明:子宫冲胚法的平均采卵数和平均获胚数极显著高于子宫切碎法(P0.01),而平均可用胚数显著高于子宫切碎法(P0.05),两种方法的平均未受精卵数则差异不显著(P0.05),说明冲胚方法对小鼠超数排卵效果的影响显著,且子宫冲胚法明显优于子宫切碎法。小鼠早期胚胎发育观察结果表明:超排处理后,在公母鼠合笼后76~79.5 h采胚,胚胎大多处于桑椹胚期,而在公母鼠合笼后88~91.5 h采胚,胚胎大多处于致密桑椹胚期与囊胚期;采用TCM199+15%胎牛血清培养液对小鼠胚胎进行体外培养是可行的。     

山羊转基因克隆胚在体内和体外发育的研究

探讨了体内/外成熟卵母细胞、体内/外培养系统、输卵管液和输卵管上皮细胞共培养系统对转基因克隆胚发育的影响。结果表明:体内/外成熟卵母细胞对转基因克隆胚各阶段发育率无显著影响。体内/外培养系统中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率差异不显著;16-细胞和桑/囊胚发育率差异显著。对照组和20%输卵管液中,转基因克隆胚2～3-细胞、4-细胞、8-细胞发育率均显著高于50%输卵管液;在20%输卵管液中16-细胞的发育率显著高于对照组和50%输卵管液。转基因克隆胚在输卵管上皮细胞共培养系统和SOF培养系统中培养,2～3-细胞和4-细胞发育率无显著差异;8-细胞、16-细胞和桑/囊胚的发育率差异显著。     

影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

 对兔胚胎细胞核移植（NT）的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100 V·mm-1，脉冲时间15μs，电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组（P<0.05）；融合前激活卵母细胞，分裂率和囊胚率显著高于融合后激活（P <0.05）；当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时，卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组；当重组胚在含3%发情牛血清（OCS）的TCM199中培养48 h后，转入含10% FCS的TCM199中继续培养，卵裂率和囊胚率显著高于一直在3% OCS或10% 胎犊血清（FCS）中培养的重组胚（P < 0.05）。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内，34 d后产下NT仔兔1只。结果表明，电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响，在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。     

Effect of GPAG Supplement on Porcine Oocyte Maturation and Its Following Embryonic Development by Parthenogenetic Activated

The aim of this study was to compare the effect of GPAG and commonly used FCS on porcine oocyte maturation and subsequent embryonic development after the fertilization. COCs were aspirated from follicles and cultured for 16, 24, 32, 40 and 48 h in TCM-199 medium either with GPAG or FCS. After 24 h with GPAG, 89.4% of oocytes reached M Ⅰ stage while in the medium supplemented with FCS, only 27.7% of oocytes reached the same stage （P〈0.05）. Prolonged incubation for up to 32 h clearly demonstrated that some of oocytes cultured in GPAG medium were at M Ⅱ stage （35.7%）, few of oocytes from FCS medium were at M Ⅱ stage （7.5%） （P〈0.05）. Both groups of oocytes reached the same stage of maturation within 48 h. After 48 h of culture, the oocytes with extruded polar bodies were inseminated. Fertilized oocytes were cultured in PZM3 medium supplemented with 3 mg.mL of BSA. After 7 days, the development and the quality of embryos were evaluated. The results showed that the maturation of oocytes in the presence of GPAG significantly increased their subsequent developmental ability when compared with FCS supplementation （29.2% ： 18.9% of blastocysts, P〈0.05）. However, differential staining revealed that once blastocysts were formed in either group, they had the same total cell number （39 ： 38） and the ICM/total cell ratio （0.26 ： 0.28）     

培养条件对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟及受精的影响

对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养及体外受精培养条件进行筛选,结果表明:在基础培养基中添加FCS可以显著提高卵母细胞的体外成熟率,而添加10%、15%和20%FCS的组间,卵母细胞的成熟率差异不明显,表明在基础培养液中添加10%FCS即可使绵羊卵母细胞的体外成熟率达到一个比较高的水平;体外培养时间不同对绵羊卵母细胞的成熟有较大的影响,培养24 h和26 h的卵母细胞成熟率(分别为73.3%和77.5%)显著高于培养18 h和20 h的卵母细胞成熟率(分别为62.5%和65.0%);对活力较低的绵羊精子而言,采用直接上浮法要比离心洗涤法更有利于选取活力较高的精子,并可提高受精卵的卵裂率.     

小鼠早期胚胎体外培养的实验研究

本试验采用国产化学试药和哈尔滨地区的天然水,制备了 Brinster 化学合成培养液。把160枚通过超数排卵获得的2-细胞期小鼠胚胎放在添加适量牛血清白蛋白或胎牛血清的 Brinster 化学合成培养液内,并在适当湿度、5%CO_2和95%空气的气相环境、37℃温度条件下培养。58小时后,大约67%4小鼠2-细胞期胚胎发育到桑椹胚阶段;大约32%的小鼠桑椹胚发育到囊胚期阶段。试验证明,用国产化学药品和哈尔滨地区水配制的培养液可以对早期小鼠胚胎进行体外培养研究。