转基因抗虫棉毒蛋白含量时空变化及抗棉铃虫效果初探

采用ELISA法(酶链免疫法)、室内初孵棉铃虫生化检测法,研究和分析了单价(Bt)转基因抗虫棉及双价(Bt/CpTI)转基因抗虫棉不同生育期以及花铃期不同器官的杀虫蛋白含量、棉铃虫死亡率变化趋势以及它们之间的关系.结果表明,转Bt基因棉Bt杀虫蛋白含量在棉花生育过程中呈时空动态变化.在时间分布上,各生育期顶尖平展叶表现为:初花期＞蕾期、花铃期＞苗期＞吐絮期;在花铃期,各器官表现为:功能叶＞嫩叶＞小蕾、幼铃＞花器官＞苞叶＞老叶.室内生化测定幼虫死亡率与棉株Bt杀虫蛋白含量动态变化一致;3份材料间Bt蛋白含量以502最高,503最低,119居中;抗虫性则以503较好,502和119的抗虫性表现与各自Bt蛋白含量一致.     

抗虫棉晋棉38的抗虫基因在不同生育期各器官中的表达

利用PCR扩增技术筛查双价抗虫棉晋棉38的单株,对确证的转基因植株的不同生育期和不同的组织器官分别通过叶片离体饲喂棉铃虫进行抗虫性检测和通过ELISA技术检测抗虫基因的表达量。结果表明晋棉38不同发育期的不同器官中Bt杀虫蛋白含量在苗期含量较高,蕾铃期则有所下降;并且在苗期叶片的杀虫蛋白含量为最高,茎和根次之;在蕾铃期各器官的表达量顺序为:叶>苞叶>茎>花瓣>花丝>铃内。整个生长发育期的抗虫性前期抗性高于后期,抗虫性显示下降的趋势。然而抗虫棉晋棉38在整个生育期的抗虫性均为高抗水平,在各个组织器官的表达量也较高。     

转Bt基因抗虫棉Bt毒蛋白表达量的时空变化

采用抗体夹心ELISA技术 ,对转Bt基因抗虫棉植株中Bt毒蛋白含量进行了测定。结果表明 :Bt基因在所检测的器官中均有表达 ,但是不同器官中的Bt毒蛋白含量明显不同。在苗期全展功能叶中Bt毒蛋白含量最高 ,根、茎和叶柄中含量较低 ;不同生育期的功能叶中Bt毒蛋白含量差异显著。Bt毒蛋白含量在苗期叶片中最高 ,蕾期次之 ,花铃期最低。随着棉花生长发育进程的推进 ,Bt基因在叶片中的表达强度逐渐减弱。Bt基因在棉株体内的表达随着器官的不同 ,生育时期的不同而表现出时空动态变化。     

转Bt基因抗虫棉外源Bt蛋白的差异表达

【目的】研究转Bt基因抗虫棉外源Bt蛋白表达的时空规律,明确Bt蛋白表达量和转Bt基因抗虫棉抗性的内在联系,更加有效降低靶标害虫危害。【方法】采用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)蛋白定量检测方法,以转Bt基因抗虫棉鄂抗虫棉1号(GK19)为研究材料,对转Bt基因抗虫棉不同组织器官、不同生长时期主茎功能叶和不同生长时期主茎不同叶位叶片的Bt蛋白含量进行检测。【结果】转Bt基因抗虫棉不同组织器官Bt蛋白含量存在差异,苗期叶片最高,花、蕾、铃次之,根、茎较低;不同生长时期主茎功能叶Bt蛋白含量呈现出随生长发育时间推进而降低的趋势;不同生长时期主茎不同叶位叶片Bt蛋白含量差异较大,苗期和盛蕾期第1~7叶呈现出逐渐下降的趋势,而盛花期和盛铃期第1~7叶呈现出先缓慢升高后逐渐稳定的趋势。【结论】Bt蛋白在转Bt基因抗虫棉各生长时期,各组织器官都有表达,且表达量呈时空动态变化。     

高温对转基因抗虫棉中Bt杀虫基因表达的影响

 Bt抗虫棉中Bt杀虫基因能否稳定表达是影响转基因抗虫棉应用前景和商品化生产的重要因素。以转基因双价抗虫棉139-20的R5代材料，通过不同温度处理，研究温度处理对Bt杀虫基因表达的影响。结果表明，温度变化影响抗虫棉早期的生长发育和Bt杀虫基因的表达，从而影响了抗虫棉生长发育过程中Bt杀虫蛋白含量降低的时间。高温处理后可使Bt杀虫基因在生长发育期中的沉默时间提前，导致Bt杀虫蛋白含量急剧降低，具体原因可能是由于转录后水平的基因表达调控，引起特异Bt 杀虫基因mRNA的降解。因此，在生产实际中，应予以提前采取措施，预防高温期棉铃虫危害。     

Bt玉米杀虫蛋白含量的时空表达及对亚洲玉米螟的杀虫效果

 利用ELISA方法对2个转Cry1Ab基因抗虫玉米品种MON810和Bt11在不同生育期、不同组织器官中杀虫蛋白的表达量进行了分析,利用室内生测方法研究了不同组织器官对亚洲玉米螟初孵幼虫杀虫效果,并分析了杀虫蛋白表达量与杀虫效果的相关性。结果表明,Cry1Ab杀虫蛋白在Bt玉米MON810和Bt11的不同生育期和组织中的表达量呈明显的时空动态变化,以营养生长阶段的心叶组织表达最高,分别为1880.6和1473.1ng·g-1,生殖生长阶段的花粉含量最低,分别为52.3和73.3ng·g-1。随着叶片的生长,     

转Bt基因抗虫棉金杂棉3号对棉铃虫抗性的研究

通过检测分析,转Bt基因抗虫棉金杂棉3号是抗棉铃虫优良的新品种,在棉花不同的生育期,Bt杀虫蛋白含量幅度在94.2-896.8 ng·g^-1,苗期、蕾期、花期的叶片Bt蛋白表达量级属于高表达,蕾期的小蕾和花期的花瓣Bt蛋白表达量级属于中高表达,花期的小蕾、铃期花瓣和小蕾Bt蛋白表达量级属于中表达,花期的小铃、铃期叶片和小铃Bt蛋白表达量级属于低表达。金杂棉3号的杀虫活性80.21%-91.87%,抗虫效率达83.33%-100.00%,保蕾效果达82.56%-100.00%。     

2个转基因抗虫杂交棉Bt蛋白含量的时空表达特性研究

采用双抗夹心酶联免疫(enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA)的方法,分析了2个转苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)基因杂交棉(浙大13-1和浙大13-2)以及转Bt基因纯系亲本不同生育期和不同器官的Bt蛋白表达规律。结果表明,Bt基因在所检测的转基因抗虫杂交棉品种和转基因纯系亲本各器官中均有表达,但不同器官Bt蛋白含量明显不同,品种之间各器官的Bt蛋白含量也有明显差异。2个转基因抗虫杂交棉品种苗期以三叶期的子叶最高,苗期叶片次之;苗期根系和茎秆中Bt蛋白表达呈抛物线形,分别在第33天和第40天达到峰值,其中根系表达量高于茎秆。叶片中的Bt蛋白含量随着棉花生长发育进程而降低,盛花期Bt蛋白含量最低,之后又有所增强,整个生育期呈"V"字形规律。转基因抗虫杂交棉品种盛花期棉株各器官中,花药的Bt蛋白含量显著高于同期其他器官。2个杂交棉品种之间各器官的Bt蛋白含量的趋势基本相同,但浙大13-1器官中的Bt蛋白含量大多高于浙大13-2。亲本各器官中的Bt蛋白含量高于其杂交棉品种,但植株生长后期的叶片和花药中的Bt蛋白低于其杂交棉品种,二者有明显差异。     

转基因抗虫棉Bt毒蛋白含量时空变化及土壤降解研究

[目的]研究转基因抗虫棉Bt毒蛋白含量的时空变化及其土壤降解。[方法]采用ELISA法(酶链免疫法)研究和分析了转Bt-cry1Ac基因抗虫棉的根、茎和叶片组织在不同发育时期毒蛋白的含量变化及转Bt基因抗虫棉(GK45)和非转基因棉花(新陆早36号)在根际土壤、表层土壤和后茬种植区土壤中Btcry1Ac毒蛋白的年平均含量变化。[结果]BtCry1Ac毒蛋白含量在抗虫棉生长过程中均呈动态下降趋势,而根中下降的速率最快,茎和叶片次之;棉花种植区土壤表层中均检测到Btcry1Ac毒蛋白,且后茬种植区中表层毒蛋白的含量增加,而根际土中含量极低。[结论]Btcry1Ac毒蛋白的含量检测为种植转基因作物的风险评价及转基因作物的土壤生态系统安全性评价提供了科学依据。     

转基因抗虫棉Bt毒蛋白含量时空变化及土壤降解研究(英文)

[目的]研究转基因抗虫棉Bt毒蛋白含量的时空变化及其土壤降解。[方法]采用ELISA法(酶链免疫法)研究和分析了转Btcry1Ac基因抗虫棉的根、茎和叶片组织在不同发育时期毒蛋白的含量变化及转Bt基因抗虫棉(GK45)和非转基因棉花(新陆早36号)在根际土壤、表层土壤和后茬种植区土壤中Btcry1Ac毒蛋白的年平均含量变化。[结果]BtCry1Ac毒蛋白含量在抗虫棉生长过程中均呈动态下降趋势,而根中下降的速率最快,茎和叶片次之;棉花种植区土壤表层中均检测到Btcry1Ac毒蛋白,且后茬种植区中表层毒蛋白的含量增加,而根际土中含量极低。[结论]Btcry1Ac毒蛋白的含量检测为种植转基因作物的风险评价及转基因作物的土壤生态系统安全性评价提供了科学依据。     

基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

【目的】研究Cry1Ac蛋白通过棉花、棉蚜的传递对普通草蛉酶活性及生长发育的影响,为转Bt基因棉花的安全性评价提供参考和依据。【方法】采用ELISA方法,检测Bt棉、取食Bt棉的棉蚜和捕食棉蚜普通草蛉体内Bt杀虫蛋白含量;通过酶活力测定普通草蛉幼虫取食Bt棉花上棉蚜后其体内的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的酶活性;室内生物测定普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后对其生长发育的影响。【结果】Cry1Ac杀虫蛋白在棉叶中的表达量为788.76 ng/g,远高于棉蚜体内的2.35 ng/g,取食Bt棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白;通过三级营养传递的Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力影响甚微。【结论】棉蚜取食Bt棉花后体内仅能累计微量Cry1Ac蛋白;普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后,对其体内三种酶活性和生长发育均没有负面影响。     

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。     

土壤水分亏缺对Bt棉铃壳杀虫蛋白表达的影响

【目的】研究土壤水分亏缺对Bt棉杀虫蛋白含量及Bt基因表达、氮代谢酶活性的影响,为Bt棉抗虫性安全表达提供理论参考。【方法】2014—2015年以Bt棉常规品种泗抗1号、杂交种泗抗3号为材料,采用盆栽法,2014年设置5个土壤水分处理:G1、G2、G3、G4和CK,其土壤含水量分别为最大持水量的15%、30%、45%和75%。2015年设置4个处理:G2、G3、G4和CK。观察土壤水分亏缺对盛铃期Bt棉铃壳杀虫蛋白含量影响。所有处理于盛花期前10 d控制浇水,如遇下雨,将处理盆钵移入室内。使用WET土壤三参数速测仪监测土壤水分,用称重法控制土壤水分,即当监测发现土壤水分低于设计值时,于早晨、中午、傍晚进行定量补水。2015年进一步研究水分亏缺对Bt基因表达量、氮代谢相关合成酶(硝酸还原酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶)活性、分解酶(肽酶和蛋白酶)活性的影响。【结果】与对照(土壤含水量为最大持水量75%)相比,泗抗1号和泗抗3号铃壳中Bt蛋白含量随土壤水分亏缺程度的增加而降低,且在土壤含水量为最大持水量60%时开始显著下降,但泗抗1号下降幅度低于泗抗3号,其中2014年泗抗1号下降22.5%,泗抗3号下降41.6%。在土壤含水量为最大持水量60%时,铃壳中Bt基因表达量增加,泗抗1号、泗抗3号分别比对照提高48.6%和22.1%。氮代谢相关酶活性变化表明,水分亏缺条件下,2个类型品种的硝酸还原酶(NR)和谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)活性降低,肽酶和蛋白酶活性增加。且肽酶和蛋白酶活性变化幅度高于NR和GPT。相关分析表明,NR和GPT活性与铃壳中杀虫蛋白含量呈显著或极显著正相关;肽酶和蛋白酶活性与杀虫蛋白含量呈显著负相关。【结论】水分亏缺胁迫下,供试品种铃壳中杀虫蛋白质含量下降。但在转录水平,未发现Bt基因表达量下降。但氮代谢关键合成酶(NR和GPT)活性降低,分解酶(肽酶和蛋白酶)活性增加。因此,蛋白质合成减弱、分解加强可能导致铃壳中杀虫蛋白含量下降。     

转Bt基因抗虫棉对棉蚜个体生长发育和繁殖能力的影响

[目的]研究转Bt基因抗虫棉对棉蚜的个体生长发育及繁殖能力的影响.[方法]在室内研究转Bt基因棉(处理)和常规棉(对照)对棉蚜个体生长发育及繁殖能力的影响.[结果]转Bt基因抗棉铃虫棉对棉蚜发育速度、成蚜寿命、4龄若蚜体重、成蚜繁殖力无明显影响.[结论]取食转Bt基因棉花对棉蚜个体生长发育没有负面影响,转Bt基因棉花对棉蚜生长发育和繁殖是安全的.为转Bt基因抗虫棉对棉蚜的生态安全性评价提供相关依据.     

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

 采用ELISA方法研究了Bt棉花叶片中Cry1Ac杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明，不同环境下Bt杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中，Bt杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快，经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态（含量50 ng·g-1左右）。高温低湿条件下，Bt杀虫蛋白降解较快，达到稳定水平的时间短。Bt杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速，30 d后降解了85%左右。随着冬季的到来, 杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后，杀虫蛋白的降解加快，至 4月下旬检测不到Bt杀虫蛋白。     

农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

温度和土壤水分与Bt棉铃壳中杀虫蛋白表达关系及其氮代谢生理机制

【目的】明确温度和土壤水分对Bt棉杀虫蛋白含量及其氮代谢活性的影响,为生产中Bt棉抗虫性的安全稳定利用提供理论参考。【方法】2016-2017年以转Bt抗虫基因抗虫棉常规品种泗抗1号（SK1）和杂交种泗抗3号（SK3）为材料,采用盆栽法,设置29℃、32℃、35℃、38℃ 4个温度水平,土壤最大持水量的80%、70%、60%、50%、40% 5个土壤水分水平,观察温度和土壤水分对Bt棉铃壳杀虫蛋白含量的影响,各处理持续胁迫4 d。2016年主要研究各处理对Bt棉铃壳中杀虫蛋白含量的影响;在此基础上,2017年进一步探讨各处理对铃壳中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）、蛋白酶、肽酶活性的影响。【结果】SK1和SK3杀虫蛋白含量均在32℃、最大持水量为60%时最高,分别达到471.1 ng·g^-1 FW和351.7 ng·g^-1 FW。在同一土壤水分条件下,32℃最利于SK1和SK3杀虫蛋白表达;同一温度条件下,最大持水量60%利于SK1和SK3杀虫蛋白表达。对杀虫蛋白含量与温度和土壤水分关系进行二元多项式回归分析发现,Bt棉杀虫蛋白含量（Y）与温度（X₂）和土壤水分（X₁）呈二元二次方程关系,其中SK1、SK3相关方程分别为Y=-3230.2+17.2X₁+199.1X₂-0.3X₁²-3.7X₂²-0.7X₁X₂ （r＝0.829^**）、Y=-3322.0+40.7X₁+145.2X₂-0.3X₁²-2.0X₂²-0.3X₁X₂（r＝0.739^**）。SK1的杀虫蛋白表达量最大的温度和土壤水分条件为31.8℃、57.8%,SK3为33.2℃、60.8%。氮代谢相关生理特征表明,SK1和SK3均表现为在32℃和土壤含水量为60%处理下,棉铃中可溶性蛋白含量、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）活性较高,蛋白酶、肽酶活性较低;杀虫蛋白含量与可溶性蛋白和GOT活性呈极显著正相关关系（r＝0.613**;r＝0.735**）,与蛋白酶活性和肽酶活性呈极显著负相关关系（r＝-0.724**;r＝-0.738**）。【结论】温度和土壤水分通过调控蛋白质分解和合成,共同影响Bt棉杀虫蛋白表达,且与其含量呈二元二次方程关系。     

转基因抗虫水稻中Bt蛋白表达量的研究

[目的]对转基因抗虫水稻中Bt蛋白表达量进行研究。[方法]应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测转基因抗虫水稻生相同生长时期不同部位的Bt蛋自表达量。[结果]转基因水稻灌浆期不同组织中Bt蛋白表达绝对含量的高低顺序为:叶片>未成熟种子及颖壳>根>茎杆;在水稻不同的生长发育(分蘖期、抽穗期和灌浆期)阶段,转基因Bt水稻中Bt蛋白的含量有一些变化;一般在水稻生长后期Bt蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。[结论]该试验对田间害虫的防治以及转基因水稻的育种都具有重要意义。     

转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空动态

以转Bt基因抗虫棉 33B为材料 ,利用ELISA检测方法 ,通过对棉株不同发育时期和同一时期的不同组织或器官Bt晶体蛋白含量的测定 ,研究了转Bt基因抗虫棉Bt基因表达的时空变化。结果表明 ,随着棉株生育进程的推进和株体的老化 ,Bt晶体蛋白含量随着植株体内可溶性总蛋白含量的逐渐降低而降低 ,而Bt基因的表达强度从苗期到蕾期随着棉株营养生长的加快而呈上升趋势 ,至蕾期达到高峰 ,以后逐渐减弱。不同组织或器官Bt晶体蛋白的含量也有较大差异 ,表现在幼嫩组织或器官的含量较高 ,成熟组织或器官次之 ,衰老组织最低。这说明Bt基因表达强度的减弱和Bt晶体蛋白含量的降低是转Bt基因抗虫棉生育后期抗虫性降低的根本原因