枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

【目的】探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化,以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因(NiR)和NLP转录因子的响应表达,分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件(nitrate-responsive cis-element,NRE)位点绑定互作。【方法】以一年生的砧木枳为试验材料,进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫,并设置对照。利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量,并同步利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和2-ΔΔCT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况。通过基因克隆并检索与比对分析,获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列,之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体,将构建的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中,在氨基酸缺失培养基(SD/-Trp/-Leu,以及SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L~(-1) 3-氨基三唑)上30℃恒温培养3—5 d,观察酵母的生长情况,以确定枳NLP转录因子(PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8)与NRE的互作关系。【结果】受干旱的影响,枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势,而侧根中全氮含量则显著下降;在对照中,枳叶片和侧根全氮含量均显著上升。RT-qPCR分析表明,PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调,而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调;PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律,而PtNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制。通过克隆测序分析,在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE。酵母单杂交分析表明,转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和p GADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基(-Trp/-Leu)和含有120 mmol·L~(-1) 3-氨基三唑的三缺培养基(-His/-Trp/-Leu)上均能正常生长。【结论】枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降,以对照为参比,枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少。氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件(NRE)位点绑定互作,从而激活下游基因的表达。     

与逆境胁迫相关的rd29A启动子和CBF2基因的克隆及其表达载体构建

以拟南芥为材料,通过PCR扩增成功地克隆了逆境诱导型启动子rd29A和CBF2转录因子.序列分析表明,951 bp的rd29A序列包含完整的DRE、ABRE等4种保守顺式作用元件;651 bp的CBF2基因包含了完整的AP2 DNA结合域以及特异的氨基酸序列PKKPAGRKKFRETRHP和FADSAWR.同时,构建了由rd29A启动子调控的CBF2基因的植物表达载体.     

水稻磷胁迫响应基因OsRCI2-9的克隆及功能鉴定

【目的】分析水稻OsRCI2-9的功能,进而解析其耐低磷胁迫的作用机制,以利于磷高效作物的改良与选育。【方法】通过对比分析水稻磷信号中心调控因子OsPHR2超表达（OsPHR2(O)）与干涉（OsPHR2(Ri)）转基因植株和野生型植株基因芯片数据,发现一个在OsPHR2(O)背景下诱导表达的RCI2家族基因--OsRCI2-9,首先利用实时荧光定量PCR对芯片数据进行验证。然后根据TIGR上的基因序列设计引物,扩增其全长cDNA;进而利用DNAStar来寻找其开放阅读框,并利用TMHMM2.0对蛋白序列的跨膜结构进行预测;在Phytozome中利用BLAST搜索拟南芥和玉米中的同源基因,并将OsRCI2-9与拟南芥RCI2、玉米RCI2家族的蛋白序列利用Clustal X 1.8进行多重序列比对和同源性分析;利用MEGA 5.2.1软件的最大似然法对同源蛋白构建进化树;利用植物顺式作用元件数据库PLACE分析启动子序列中的顺式作用元件;利用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测OsRCI2-9在不同胁迫处理条件下的表达模式;将OsRCI2-9的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pCAMBIA1300表达载体中构建其超表达载体并发展转基因材料,对其表型进行分析,并对转基因植株的有效磷进行测定。【结果】OsRCI2-9位于水稻第6染色体上,基因全长237 bp,由2个外显子和1个内含子组成,编码78个氨基酸。OsRCI2-9含有2个跨膜结构域,其在序列上与玉米ZmRCI2-2、ZmRCI2-7和ZmRCI2-8同源性较高;通过启动子序列分析发现OsRCI2-9启动子含有干旱、低温,ABA、细胞分裂素、赤霉素及磷饥饿响应等元件;RT-PCR和实时荧光定量PCR发现OsRCI2-9受到缺磷处理的强烈诱导,在根中OsRCI2-9还受到缺钾和缺铁的少量诱导及缺氮的微量抑制。进一步研究发现在正常磷浓度下,OsRCI2-9超表达转基因植株与野生型相比,表现为生长缓慢,分蘖数减少,而在低磷条件下,表型与野生型差别不大。通过测定有效磷含量发现OsRCI2-9超表达转基因植株在正常磷浓度与缺磷条件下较野生型植株有效磷含量均有明显的提高。【结论】OsRCI2-9参于了植物体内磷平衡调控。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

木薯MeMYB63 基因特性及启动子活性初步分析

为了解木薯干旱相关的MeMYB63基因的基本特性,从木薯中克隆了干旱诱导的调控基因MeMYB63的全长cDNA及起始密码子上游1 500 bp的DNA片段,在转基因拟南芥中对该基因的启动子活性进行了初步分析.利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)对MeMYB63蛋白进行标记,通过烟草瞬时转化系统观察融合蛋白的亚细胞定位.利用酵母转化试验确认MeMYB63是否具有转录激活功能.结果表明,MeMYB63基因5'上游1543 bp的片段具有明显启动子特征.MeMYB63蛋白的亚细胞定位试验发现MeMYB63与GFP融合的蛋白产物仅在细胞核出现,酵母转录激活试验表明,MeMYB63具有明显的转录激活功能,说明该基因具有转录激活结构域.亚细胞定位及转录激活试验结果表明,MeMYB63可能是一个转录因子,为今后进行该基因功能的研究提供了重要依据.     

观赏海棠McWRI1基因克隆与分析

【目的】WRI1是一个参与调控植物种子油脂合成的转录因子,其与下游靶基因启动子区域特异的DNA序列结合,调控植物种子油脂合成相关基因的表达,但其在植物表面蜡质合成中的功能很少报道。【方法】运用PCR技术克隆McWRI1基因全长的cDNA,实时荧光定量PCR测定McWRI1在苹果属花红、楸子、槟子以及新疆野苹果中的表达,选择楸子作为代表,测定McWRI1与蜡质合成相关基因,如McWAX,McKCS,McKPHMT,McPKM2,McLACS表达的关系,GC-MS测定果皮蜡质成分。【结果】结果表明,McWRI1基因全长1 221bp,共编码406个氨基酸;氨基酸序列比对、系统进化树分析表明McWRI1具有典型的AP2家族结构域;观赏海棠McWRI1与苹果MdWRI1的氨基酸序列一致性较高。在供试的4个苹果种果实中,花红的McWRI1表达量最高,新疆野苹果最低,槟子与楸子居中。以楸子为试材,设置低温处理组,可见低温处理抑制McWRI1的表达,同时下调McWAX,McKCS,McKPHMT和McLACS,并且导致二十三烷、二十九烷、亚油酸、油酸以及十六烷酸-十八烷酯的含量有明显的上升。分析认为,McWRI1可能直接和间接调控超长链脂肪酸的合成、蜡质的脂肪酸的合成以及CoA供给参与观赏海棠果实表面蜡质的合成。