卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用，为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层，检测c-myc mRNA和蛋白的表达；应用50 ng·mL^-1FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度，检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达；体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞，预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后，加入50 ng·mL^-1 FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡，卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比，FSH处理后，小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上，FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平...     

BMP15基因在不同品种鸡卵泡中的表达规律

以淮南麻黄鸡和邵伯鸡为试验素材,研究骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因在2个群体卵泡颗粒层和膜层中的表达模式及差异。结果表明,在颗粒层中,BMP15在2个群体的卵泡不同发育时期表达模式均呈先增加后降低的趋势,发育到小黄卵泡(small yellow follicle,SFY)时期呈现表达高峰,显著高于其他各等级卵泡的表达量(P0.05,P0.01),之后表达量显著下降;不同时期同一等级卵泡颗粒层中的表达均表现为24周高于43周,小黄卵泡时期表现为24周显著高于43周(P0.05)。在膜层中,BMP15在2个品种的卵泡不同发育时期表达模式均呈"低→高→低"的趋势,表达高峰出现在小黄卵泡(SYF)时期,显著高于其他各等级卵泡的表达量(P0.05)。不同时期同一等级卵泡膜层中的表达基本相似,均表现为24周表达量高于43周,在小黄卵泡(SYF)时期膜层表达量表现为24周显著高于43周(P0.05)。BMP15基因的表达量在各级卵泡的颗粒层和膜层在2个群体间差异不显著。综合BMP15在2个群体不同时期卵泡的颗粒层和膜层中的表达模式研究表明,BMP15在鸡的卵泡发育过程中的表达存在时间、品种和组织差异性。     

PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞的表达及其与卵泡液孕激素含量的关系研究

为研究丝氨酸蛋白酶23(PRSS23)在蛋鸡卵泡中的表达部位及其mRNA在颗粒细胞中的表达与孕激素(P_4)分泌的关系,选取直径为3～5 mm的大白卵泡(LWF)和直径为6～8 mm的小黄卵泡(SYF),应用免疫组织化学技术对PRSS23进行组织定位;分别选取小白卵泡(SWF)、LWF、SYF、大黄卵泡(LYF),用1 mL注射器抽取卵泡液,测定不同大小等级前卵泡卵泡液中P_4的含量;刮取位于卵泡内膜上的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测PRSS23基因mRNA在蛋鸡不同大小等级前卵泡颗粒细胞中的表达情况。结果显示,PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞层、膜细胞层和卵丘细胞均有表达,在SYF颗粒细胞层表达量最高;PRSS23基因mRNA在SYF中的含量显著高于其他卵泡(P0.05);P_4在SYF卵泡液中的含量显著高于其他卵泡卵泡液(P0.05)。以上结果表明,PRSS23在SYF中可能会通过促进颗粒细胞分泌P_4来影响卵泡的选择。     

山麻鸭卵泡发育的形态学及激素分泌调控基因的表达研究

为探讨各阶段山麻鸭卵泡发育水平以及激素分泌调控基因的表达情况,对不同发育等级山麻鸭卵泡壁的形态进行了观察,并检测了ＣＹＰ１９Ａ１和３β-ＨＳＤ基因的表达量．研究发现,发育过程中颗粒层和膜层细胞数量不断增加,密度和厚度也随着细胞的增殖而增长．对产蛋期山麻鸭卵泡膜层和颗粒层ＣＹＰ１９Ａ１和３β-ＨＳＤ的表达量进行检测结果表明,卵泡颗粒层的ＣＹＰ１９Ａ１基因主要在等级前阶段表达,３β-ＨＳＤ基因主要在等级阶段表达,卵泡膜层的ＣＹＰ１９Ａ１和３β-ＨＳＤ基因则主要都在等级阶段表达．     

鸡YAP1基因在不同生长发育时期卵泡中的时空表达分析

为探讨YAP1基因在鸡卵泡生长发育中的调控作用,以150 d海兰褐蛋鸡为供试材料,采用相对定量RT-PCR方法对YAP1基因在鸡卵巢组织不同发育时期卵泡中的mRNA转录水平进行检测分析,并用免疫组织化学方法对YAP1蛋白质分子在鸡前等级卵泡中的时空表达模式进行蛋白定位分析。结果表明:鸡YAP1基因mRNA在卵巢间质、前等级卵泡和不同等级化的卵泡中均有表达,但在不同等级的卵泡中表达差异不显著(P0.05),呈现出组成型表达的特点。鸡YAP1蛋白质分子主要在卵巢间质组织、前等级卵泡卵母细胞和颗粒细胞中有表达,但在膜层细胞中未检测到其表达信号。此结果表明,YAP1分子可能主要以自分泌或旁分泌的方式在前等级卵泡的生长发育过程中发挥着重要调节作用。     

PDGF及其受体mRNA在鹅不同等级前卵泡中的表达差异

为探讨血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)及其受体(PDGFR)mRNA在鹅等级前卵泡中的表达差异及生物学意义。选取健康的产蛋前期和产蛋期籽鹅各3只为试验材料,利用实时荧光定量PCR方法检测PDGF和PDGFR mRNA在产蛋前期和产蛋期鹅等级前卵泡(分为SYF、LWF、MWF、SWF、PE 5个等级)中的表达差异。结果表明:产蛋期PDGF及其受体mRNA在5个等级前卵泡中的表达量均高于产蛋前期(P0.05),说明PDGF及其受体mRNA对卵泡发育有促进作用;产蛋前期和产蛋期PDGF及其受体mRNA表达量均在初级卵泡(PE)中最高,说明初级卵泡是主要表达部位,其中颗粒细胞形态由扁平变成立方形后开始大量增殖,通过促进颗粒细胞的增殖进而促进卵泡发育;在初级卵泡向小白卵泡(SWF)发育过程中,PDGF及其受体mRNA表达量有明显下降(P0.05),推测这可能与PDGF抑制类固醇的合成进而抑制卵泡发育有关,使优势卵泡更有序的进行筛选。     

WNT6基因对蛋鸡卵泡颗粒细胞的影响及机制研究

[目的]本文旨在研究WNT6基因在蛋鸡卵泡发育过程中的生物学功能及其作用机制。[方法]以300日龄海兰蛋鸡为研究对象，检测WNT6 mRNA在不同组织中表达特征。对体外培养的鸡卵泡颗粒细胞进行敲减和过表达WNT6基因后，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，ELISA检测细胞培养基中的孕酮(P4)含量，荧光定量PCR检测卵泡刺激素受体(FSHR)和StAR、CYP11A1等基因表达水平。设立卵泡刺激素(FSH)浓度梯度处理体外培养的蛋鸡卵泡颗粒细胞，研究FSH对WNT6及WNT通路相关基因表达水平的影响。[结果]WNT6 mRNA在蛋鸡卵泡颗粒细胞内特异表达，在处于卵泡选择关键时期的小黄卵泡颗粒细胞内具有最高表达水平；与对照组相比，过表达WNT6极显著促进颗粒细胞增殖(P<0.01),极显著提高颗粒细胞P4合成量(P<0.01),并显著提高FSHR、CYP11A1、StAR、CYP19A1和HSD3B1基因表达水平(P<0.05);相反，敲减WNT6后颗粒细胞增殖被抑制(P<0.01),P4合成量极显著显著减少(P<0.01),并显著降低FSHR、CYP11A1...     

AMH及相关基因在山麻鸭不同等级卵泡膜层和颗粒层中的表达分析

选取6只健康且生产性能一致的产蛋高峰期山麻鸭,分别采集各级卵泡膜层和颗粒层组织,通过实时荧光定量PCR检测AMH、AMHRⅡ、SF-1和WT1在各级卵泡颗粒层和膜层中的表达规律.结果表明,AMH在等级前小黄卵泡(SY)、等级前大白卵泡(BW)中表达量较高,且膜层表达量均极显著高于颗粒层(P0.01);AMHR在颗粒层中表达模式与AMH相似;SF-1在等级卵泡的颗粒层中有较高的表达量,而在卵泡的膜层中表达量较低;WT1在最大等级卵泡(F1)、第三大等级卵泡(F3)、最小等级卵泡(F6)和SY卵泡膜层中的表达量均极显著高于颗粒层(P0.01),WT1在BW卵泡的表达量最高,并且颗粒层的表达量极显著高于膜层(P0.01).本研究表明AMH及其调控基因的表达与鸭卵泡等级发育阶段相关,且在膜层和颗粒层的表达规律具有不一致性.     

神经生长因子及其受体在蛋鸡卵巢上的表达

以83日龄性未成熟和230日龄性成熟蛋鸡各5只为试验动物,通过免疫组织化学方法和荧光定量PCR技术研究神经生长因子(NGF)及其受体酪氨酸激酶A(TrkA)和神经营养素受体p75(p75)在蛋鸡卵巢和等级前卵泡上的表达定位及其mRNA表达水平。结果表明:在83日龄性未成熟蛋鸡卵巢上均未发现NGF及其受体TrkA和p75阳性表达细胞,但在230日龄等级前卵泡的膜细胞和颗粒细胞中均发现有其阳性细胞表达。NGF及其受体的mRNA表达水平在230日龄蛋鸡小黄卵泡(SYF)上的表达量显著高于各自在小白卵泡(SWF)和大白卵泡(LWF)上的表达量。此外,230日龄蛋鸡血清中的雌激素和孕激素水平都显著高于83日龄蛋鸡。综上所述,NGF可能在蛋鸡等级卵泡的生长、发育和排卵过程中起一定调节作用。     

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构,并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】 同期发情处理后,经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢,分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）;其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs）,抽提总RNA后,经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序,获得AGTR2基因全CDS区;生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析;设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物,分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况;另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后,设定阳性、阴性对照组和试验组,应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】 AGTR2 CDS区全长1 089 bp,编码362个氨基酸;牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明,该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%）,与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%;立体结构和功能域分析表明,AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构,符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征;qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P<0.01）,且差异表达倍数达7.47倍;免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达,特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】 AGTR2属于G蛋白偶联受体,符合神经肽CART受体的基本特征;本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础,同时,对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。     

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原（PCNA）参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示：原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示：PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异（43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219 , P<0.01）;【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。     

山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

高温诱导蛋鸡氧化损伤及对卵泡发育的影响

【目的】研究高温诱导蛋鸡氧化损伤及对卵泡发育的影响,探讨环境高温抑制蛋鸡卵泡发育、降低产蛋量的机制。【方法】试验分两部分进行：试验一,将180只27周龄的海兰褐蛋鸡随机分为3个处理组,分别饲养于人工环境控制舱内,3个处理组分别为常温组（23℃,饲喂基础日粮）、日循环高温组（28—35—28℃,饲喂基础日粮）和高温补充VE组（28—35—28℃,饲喂基础日粮+250 IU•kg-1 VE）,试验期14 d;试验二,分离蛋鸡F1和F2卵泡颗粒层并制备颗粒细胞悬浮液,将颗粒细胞分别在39或44℃下培养。【结果】试验一结果显示,日循环高温显著抑制蛋鸡卵泡发育,表现为产蛋数量下降（P＜0.05）、卵巢重量降低（P＜0.05）、大卵泡数量减少（P＜0.05）,同时颗粒细胞层细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（P450scc）mRNA的表达量以及孕酮（P4）分泌量均显著（P＜0.05）减少;日循环高温还诱导蛋鸡氧化损伤,表现为蛋鸡血浆、肝脏和卵黄中丙二醛（MDA）水平上升（P＜0.05）;高温环境下补充250 IU•kg-1 VE,显著降低蛋鸡血浆、肝脏和卵黄中MDA水平（P＜0.05）,同时显著缓解高温对卵泡发育的抑制（P＜0.05）。试验二结果显示,提高培养温度可显著增加颗粒细胞中活性氧（ROS）的产生量（P＜0.05）,同时抑制颗粒细胞的增殖活性（P＜0.05）;培养液中添加VE预处理24 h可显著缓解高温的影响,表现为细胞ROS降低（P＜0.05）,细胞增殖活性增加（P＜0.05）。【结论】高温增加蛋鸡颗粒细胞ROS的产生量,诱导蛋鸡机体（肝脏,血浆和卵黄）氧化损伤,同时影响颗粒细胞增殖及分泌孕酮的能力,抑制蛋鸡卵泡发育;补充VE可以缓解高温诱导的蛋鸡氧化损伤,并缓解高温对卵泡发育的抑制。表明高温抑制蛋鸡卵泡发育与诱导蛋鸡氧化损伤有关。     

LKB1基因对卵巢颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用

【背景】颗粒细胞类固醇激素的合成能力对卵泡发育及成熟具有重要作用,但其关键的调控因子尚不完全清楚。笔者前期的研究表明肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）基因参与细胞的脂类代谢,类固醇激素的合成与脂类代谢密切相关,并且有研究结果亦显示LKB1敲除可引起小鼠卵巢早衰,表明LKB1对维持卵巢的功能很关键,其在颗粒细胞的确切功能需要进一步研究。【目的】探究LKB1在牛卵泡中的表达模式及其对颗粒细胞类固醇激素生成相关基因的调控作用, 为母牛繁殖生理调控研究提供理论依据。【方法】采用免疫组织化学染色对LKB1蛋白在卵泡中进行定位研究;同时分离培养牛原代颗粒细胞,并以促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor, FSHR）蛋白作为标记基因,细胞免疫荧光染色鉴定颗粒细胞及纯度;然后以原代颗粒细胞为模型,采用siRNA沉默LKB1的技术,利用qRT-PCR方法检测LKB1功能缺失对类固醇激素合成相关基因表达的影响,另一方面采用腺病毒过表达LKB1,qRT-PCR和ELISA技术验证LKB1对类固醇激素合成相关基因表达的调控作用及雌二醇分泌。【结果】 1) LKB1蛋白在卵泡中的细胞均表达,但颗粒细胞的染色信号强于膜细胞,进一步的定量分析显示颗粒细胞的表达量显著高于卵泡膜细胞。2) 分离培养的牛原代卵泡颗粒细胞贴壁生长、细胞形态多呈圆形,能被颗粒细胞标志基因FSHR抗体标记。3) RNAi技术能显著抑制LKB1的表达。与对照相比,siRNA1和siRNA2干扰LKB1的效率分别为48% (P<0.05)和52% (P<0.05);沉默LKB1显著降低颗粒细胞类固醇激素合成基因 STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,分别下调了约为对照组的60%、80%和50%。4) LKB1过表达腺病毒及对照组对颗粒细胞均具有高的感染效率,LKB1过表达效率高达10倍（P<0.01）;过表达LKB1显著上调STAR (P<0.01)、CYP11A1 (P<0.01)和CYP19A1 (P<0.05)的表达,进一步研究显示LKB1基因功能获得促进颗粒细胞雌二醇的分泌（P<0.05）。【结论】LKB1在卵泡颗粒细胞中高表达,促进类固醇激素生成基因STAR 、CYP11A1和CYP19A1的表达和雌二醇的分泌。本研究将为LKB1调控牛颗粒细胞类固醇激素合成的功能提供直接的理论依据。     

猪卵泡闭锁过程中circINHBB的鉴定及其对颗粒细胞凋亡的影响

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA（circRNA）是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs（ncRNAs）。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素（INH）是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA（si-circINHBB）,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

Expression pattern and regulation of head-to-head genes Vps36 and Ckap2 during chicken follicle development

Vacuolar protein sorting 36 (VPS36), a protein primarily known for its role in the Endosomal Sorting Complex Required for Transport pathway, has recently been shown to be linked to chicken reproduction. Previous research showed that Vps36 is significantly downregulated in sexually mature chicken ovaries compared to immature ones. In this study, using real-time quantitative RT-PCR, we investigated the expression pattern of Vps36 and its head-to-head gene Ckap2 mRNA in chicken follicles. Small white follicles were found to have significantly higher expression of Vps36 and Ckap2 mRNA than any other sized follicles (P<0.05). The expression of Vps36 and Ckap2 mRNA were detected in both granulosa and theca layers of pre-ovulatory follicles, the expression of Ckap2 in theca layers was slightly higher than in granulosa cells. Treatment of small yellow follicles with follicle-stimulating hormone and estradiol resulted in a marked decrease of both Vps36 and Ckap2 mRNA (P<0.05); however, progesterone, transforming growth factor-β 1 and luteinizing hormone induced no significant changes in Vps36 and Ckap2 mRNA expression in these follicles. These results indicate that the head-to-head genes of Vps36 and Ckap2 exhibit similar expression in chicken follicles and are involved in chicken follicle development.     

转录组测序筛选牛卵泡发育相关基因及其表达差异分析

【目的】通过不同生理状态牛卵泡高通量测序筛选与卵泡发育相关的基因。【方法】母牛同期发情后,B超声波连续监测并适时采集第一卵泡波出现偏差前的最大卵泡(the largest follicle at predeviation,PDF1)和第二大卵泡(the second largest follicle at predeviation,PDF2),构建RNA文库后Illumina平台测序,经数据库比对,设定参数筛选高表达基因、差异表达基因并进行GO分析,Genecards基因功能查询进一步筛选与卵泡发育直接相关的调控基因,q RT-PCR对筛选的基因进行表达量验证分析。【结果】两个转录本中共获得263个差异表达基因;GO功能聚类分析共分为三大类90组:其中生物学过程占64.4%,细胞组分占17.8%,分子功能占17.8%;获得一些重要的功能富集通路,如调控信号转导和细胞因子应答的生物途径;基因表达量分析筛选出10个高表达的上调和下调基因,获得参与雌激素合成和胎儿性别发育的CYP17A1、参与类固醇激素合成的LOC785462、细胞发育过程中调节细胞凋亡的DACH1以及调节ERK和MEK1/2信号通路的MAP3K3。Genecards功能查询共获得6个基因与卵泡发育关系较为密切,其中上调基因分别为PRSS35,PTGRF,ARID4B,GPR116;下调基因为APOA1和CPXM1;q RT-PCR结果显示,PRSS35和ARID4B在DF中的表达量显著高于SF(P0.05),CPXM1在SF中的表达量极显著高于DF(P0.01),PTGRF,GPR116和APOA1在DF和SF中的表达量不存在显著差异(P0.05),但其表达变化趋势与高通量测序结果相一致。【结论】转录组测序结果真实可靠,PRSS35和ARID4B在卵泡发育过程中发挥正调控作用,CPXM1在卵泡发育过程中发挥负调控作用,获得的牛卵泡发育相关基因和重要调节途径,对后期深入探讨卵泡发育调控机理的研究具有重要意义。