水稻转基因再生植株突变体筛选的研究

在水稻遗传基因（ＣＰＴＩ） 植株抗虫性测定的同时,我们进行了转基因再生植株突变筛选的研究,发现：①水稻转基因再生植株第一代矮化现象较普遍,但大多数植株可能是受组织培养的影响,在第二代既可恢复原种性,只有少数是变异株;而变异频率较大的性状是生育期,２ 年共获得了４ 株矮化株和１２ 株早熟株;②突变体植株遗传具相对稳定性,第二代株系内即表现整齐一致、不分离;③经过基因转化处理后的再生植株发生突变的频率增大。     

水稻转基因再生植株及其后代抗虫性筛选测定研究

采用基因枪转化系统，将CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂）抗虫基因转入水稻愈伤组织中，经过抗生素筛选得到了再生植株。我们用这些转基因水稻再生植株及其后代的分蘖茎段对玉米螟（Ostrinia nubilalis)进行室内喂养，通过比较虫体死亡率及虫体生长长度，测定转基因水稻再生植株的抗虫性。1997－1999年共进行3个世代5次的室内测定。从121株F0代转基因植株中选出抗虫性较好的植株15株。从F1代的15个株系中，又筛选出了7个株系40个单株；在F2代的14个株系中共选出37株抗虫效果表现较好的植株。对37株中的19株进行了分子检测（PCR扩增），从中检测出5份材料为纯合体，14份材料有分离现象。研究结果表明：该富内喂养玉米螟并进行抗虫测定的方法是可行的；抗虫基因在转基因水稻再生植株中已经获得表达并且可以遗传。     

水稻多胺氧化酶基因（OsPAO4）CRISPR/Cas9 编辑突变体的创制

【目的】稻瘟病是水稻生产上的重要限制因素,挖掘与利用抗病基因是实现水稻高产稳产的重要保障。前期研究发现,稻瘟病抗性相关osa-miR-21可能通过靶向调控多胺氧化酶基因OsPAO4调节水稻稻瘟病抗性,但目前多胺氧化酶(Polyamine oxidases,PAOs)在水稻抗病中的功能研究尚未见报道。为进一步探究其在水稻抗病中的可能生物学功能,本研究利用CRISPR/Cas9编辑技术对水稻OsPAO4基因进行定点编辑并对其后代突变体进行分析。【方法】在OsPAO4第2外显子处设计了1个20 bp的编辑靶点,将靶点核苷酸片段克隆至pRGEB32载体,获得OsPAO4编辑载体。随后,利用农杆菌介导法转化水稻Pik-H4 NIL愈伤组织中,经过再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T₀代植株靶位点附近DNA序列进行PCR和测序分析。【结果】OsPAO4基因被成功编辑,最终获得25个转基因阳性植株,并在T₀代产生多种突变类型：3株纯合突变、18株杂合突变和4株未发生编辑的植株。此外,T₀代杂合突变ospao4-8的颖壳颜色由...     

外源瓠瓜DNA导入西瓜的研究初报

采用ＤＮＡ浸胚法和子房注射法，将供体瓠瓜的总ＤＮＡ导入西瓜，后代Ｄ１代分别获得了１株（株系１）和７株变异株，变异率为０．３２％～１．７７％．Ｄ１代的性状变异较小，但株系１的Ｄ２代性状变异特别大，有２２．７％的果实皮色由深绿色变成白色或白皮绿网纹，接近供体皮色；其果实形状有１１．９％由圆形变成长椭圆形，１０．８％变成椭圆形，８．３％变成高圆形；其果实种子的形状和色泽有３３．３％发生变异．而其它株系的Ｄ２代性状变异较小．株系１Ｄ２代变异植株成株期功能叶过氧化物酶同工酶酶谱与受体不同，出现了供体植株的酶带．初步认为西瓜的性状变异是供体瓠瓜ＤＮＡ导入的结果．     

插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系

 通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低     

利用基因枪法获得可遗传的抗除草剂转基因水稻植株

 利用基因枪转化系统，将含有由CaMV35S启动子启动的bar基因的转化质粒pCB1导入水稻幼胚，经筛选、再生得到3株抗除草剂Basta的转基因植株。经PCR及Southern分析，在转基因植株基因组中均检测到了bar基因的整合；经RNA点杂交分析，检测到了bar基因在转基因植株中RNA水平的表达。在转基因植株JY119-2的总计321株T#-1代自交后代中，有274株表现出除草剂抗性，47株敏感。从该274株抗性植株中随机选取8株进行Southern分析，结果均检测到了bar基因的整合，表明bar基因已遗传到了T#-1代植株中。     

外源DNA导入创造抗枯萎病西瓜种质资源

采用ＤＮＡ浸胚法将供本瓠瓜的总ＤＮＡ导入导入西瓜,Ｄ１代获得一变异株,变异率为０．３２％,Ｄ２代是植株成株期功能叶过氧化物酶同工酶酶带数增加,出现了供体植株的酶带,变异株部分染色体的臂长、臂比、带型与受体相比产生了明显的差异,果实有２２．７％的皮色由深绿变成白色或白皮绿网纹,接近供体瓠瓜的皮色;果实形状有３１．０％发生变异;种子的形状和色泽有３３．３％发生变异。初步认为西瓜的性状变异是供体瓠瓜ＤＮ     

NaN_3处理对水稻体细胞培养及再生植株后代表现的效应

选用水稻广亲和系CA529、光敏不育系W6154s和W6184s三份材料,用2.0mM的NaN_3对其成熟种子进行诱变处理,观察了种胚离体培养及其再生植株R1、R2代性状。结果表明:NaN_3处理具有提高出愈率、出苗率及愈伤组织日增重量的效应;每毫克愈伤组织的日增量与出苗率呈一定的正相关;NaN_3对再生植株R1、R2代的株高有矮化效应;在CA529中获得3个株叶型优良、抗倒伏早衰的变异株系;在W6184s和W6154s的处理和培养对照(CK2)中获得3个育性表现优于亲本的株系。表明诱变与组培相结合的技术对作物改良是有效的。     

烷化剂EMS处理水稻愈伤组织诱导突变的方法初探

采用ＥＭＳ 处理水稻体细胞愈伤组织诱导变异,试验表明,采用浸渍法处理２ｈ ,ＥＭＳ 对水稻体细胞愈伤组织的半致死质量浓度为１ ～５ ｇ／Ｌ;采用滴加法处理,每管加０ ．１ ｍｌ 时,半致死浓度为５０ ｇ／Ｌ左右。根据出苗率和变异情况,用滴加法处理,每管滴加０ ．２ ｍｌ 时,处理浓度以１ ｇ／Ｌ为好。经ＥＭＳ 处理后,再生植株株系的变异频率比对照高５ ．０２ ％ 。     

基因枪法转基因水稻后代农艺性状的表现

 通过基因枪转化法，将潮霉素磷酸转移酶基因（ｈｐｔ）导入粳稻品种７７１７０和中花９号，获得转化再生植株，选其中７个结实较好的株系为试验材料，对其自交后代（Ｔ１ 和Ｔ２）的株高、穗数、穗长、穗粒数、结实率和千粒重等６个农艺性状进行调查分析。结果显示，转基因植株后代６个农艺性状都不同程度地发生了变异，ＳＧ－１的千粒重变异较大，ＳＧ－２穗数变异较大，ＳＧ－３－１结实率变异较大，ＳＧ－３－２在６个性状上都有较大的变异，ＳＧ－１５主要是在株高、穗长、穗粒数以及穗数和千粒重５个性状上有较大变异。产生这些变异的主要原因是在组织培养过程中发生了体细胞无性系变异，导入外源基因并没有直接影响农艺性状的表达。在Ｔ１和Ｔ２代中，千粒重和结实率的表现基本一致，而株高、穗数、穗长和穗粒数的遗传表现还不够稳定。因此，在Ｔ１代选育时，应注重选择千粒重和结实率表现好的株系，而对本研究涉及的其它性状可不作严格选择。     

农杆菌介导的水稻高效遗传转化体系的建立

选用５个水稻品种（０２４２８,武育粳２号,台北３０９,Ｍｉｌｌｉｎ和明恢６３）,通过农杆菌介导的转化方法,从前４个水稻品种中获得了来自３０９个独立抗性愈伤的的６３５棵再生植株,包括４２２株ＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ转基因植株和２１２株ＰＳＡＧ１２＿ＧＵＳ转基因植株,经组织化学检测和ＰＣＲ分析,获得的４２２株ＰＳＡＧ１２－ＩＰＴ转基因樾株和２１２株ＰＳＡＧ１２－ＧＳ转基因植株,经组织化学芳觳夂停校茫曳治觯     

根癌农杆菌介导的水稻两用不育系培矮64S遗传转化体系的建立

以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株.结果表明.J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PER检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达.通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗传.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T_0代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T_1代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T_2代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295μg·g~(-1),极显著(P0.01)高于非转基因对照(0.046μg·g~(-1))。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。     

冬小麦幼胚愈伤组织的辐照效果研究

以３个普通小麦品种为材料，用＾６０Ｃｏγ射线辐照小麦幼胚愈伤组织，发现植株再生率下降，在ＭＲ１代中观察到广泛的变异，再生植株的育性、株高、抽穗期、单株穗数都发生了明显变异，这些变异较未处理组织培养的再生植株变异、率大、范围广泛。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T₁代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T₂代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g ^-1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g ^-1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。     

基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑

【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表明CRISPR/Cas9在T1代转基因阳性植株中未重新发挥基因编辑作用。对20株突变体的5个潜在脱靶位点进行分析,5个潜在脱靶位点均未检测出脱靶效应,表明所设计靶序列具有较高特异性。对选取的3组不同基因型ospil15 T1代突变体表型进行初步观察,结果表明,突变体生育期和分蘖数未出现明显变化,株高极显著下降,籽粒粒长极显著增加,最大增幅达5.69%。【结论】CRISPR/Cas9系统能对OsPIL15进行定向编辑,获得的10种不同突变基因型的ospil15突变体与野生型相比株高极显著降低、籽粒粒长极显著增大。     

Xα21基因导入水稻广亲和恢复系SWR20的研究

以成熟胚愈伤组织为转化受体，经农杆菌介导法将显性广谱白叶枯病抗性基因Xα21导入高感白叶枯病的水稻广亲和恢复系SWR20中，共获得43个独立的转基因株系，100余株转基因水稻植株，经GUS活性，潮霉素抗性检测及PCR分析表明，外源基因已整合到转基因水稻基因组中，白叶枯病原菌接种试验表明，大部分T0代转基因水稻植株的抗病性有明显提高，多数植株抗或高,抗，个别为感病，经对农杆菌介导的水稻转化技术作进一步改进后，GUS瞬间表达率可高达 92．5％，稳定转化频率达到27．6％。α     

玉米无卫型气孔突变体细胞系植株的再生和遗传

通过玉米花药培养建立了能长期继代再生的单倍体胚性细胞无性系。继代培养２年后，在加入较高浓度的２．４－Ｄ的继代培养基上，再生小植株叶片出现了无卫型气孔结构的变异，建立起Ｓｍｌ玉米无卫型气孔变异体细胞系。移栽成活植株仍存在无卫型等异常气孔，经秋水仙碱加倍，获得极少雄花不育加倍植株，用其他自交系花粉授粉，得到异交结实后代，对其中ＥＡ＿１株系多代套袋自交。无卫型气孔在Ｆ＿１代植株叶片上不出现，而在其他自交后代中出现，但自交后即纯合。遗传分析表明无卫型气孔结构变异是受一对隐性基因控制，从而首次在玉米中获得无卫型气孔突变体纯系。     

转基因拷贝数对农艺性状的影响

[目的]研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[方法]以农杆菌介导的遗传转化法获得的水稻转基因植株为材料,观察其株高、分蘖、扬花、籽粒形状及饱满度、抗虫性等。同时获取PCR为阳性的单株叶片进行Southern杂交,检测转入基因的拷贝数,研究转基因拷贝数对转化植株农艺性状的影响。[结果]T0代转基因植株的农艺性状有较多改变,如白化、矮化、分蘖少及种子畸型等。转基因植株的转基因拷贝数影响其农艺性状,拷贝数越多农艺性状改变越大,目标基因越容易受到抑制而不表达。在T0代表现感虫的转化植株其T1代也表现感虫。[结论]转基因植物商品化时,应选择单拷贝的转化植株。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

【目的】OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程。利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11（ZH11）的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻产量构成因子的影响。【方法】依据CRISPR/Cas9编辑原理,在OsIAA11第1和第2外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在水稻基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与pYLgRNA-U6a和pYLgRNA-U6b载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的U6a-IAA11-T1和U6b-IAA11-T2表达盒,再将2个表达盒连接到pYLCRISPR/Cas9-MT载体上,获得pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12重组表达载体,利用农杆菌介导法转化ZH11愈伤组织,再生培养得到T₀代转基因幼苗,通过PCR扩增潮霉素抗性基因获得阳性株系。对T₂代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定OsIAA11突变类型,并考察突变植株的田间农艺性状。【结果】pYLCRISPR/Cas9-IAA11-T12表达载体成功转化ZH11水稻愈伤组织,并获得25株转基因再生植株,经潮霉素鉴定得到20株阳性株系,从阳性植株的T₂后代中鉴定出17种在2个靶点区域都发生编辑的纯合突变类型植株,除osiaa11-20-1、osiaa11-21-2、osiaa11-23和osiaa11-25在第1个靶点、以及osiaa11-22-2在第2个靶点是单碱基插入突变外,其他突变植株在第1个靶点为小片段缺失突变,在第2个靶点多为单碱基缺失突变。对17种不同基因型osiaa11突变体的农艺性状调查表明,与野生型水稻相比,突变体水稻的株高、有效穗数、穗长、穗粒数、结实率、千粒重、收获指数以及谷草比等性状未发生明显变化,而分蘖成穗率则显著降低,表明无效分蘖增多。【结论】采用CRISPR/Cas9技术对OsIAA11序列进行编辑,得到17种不同基因型的osiaa11突变体水稻,其分蘖成穗率显著降低,无效分蘖变多,表明OsIAA11参与了生长素对分蘖芽发生的调节代谢。