体外诱导大熊猫大肠埃希菌对普多沙星的耐药性及其机制研究

【目的】探究大熊猫源大肠埃希菌对新型动物专用氟喹诺酮类药物普多沙星的耐药机制。【方法】以从大熊猫体液分离的对氟喹诺酮类药物敏感的大肠埃希菌株为研究对象,采用环丙沙星、麻保沙星和普多沙星通过体外逐渐递增药物浓度的方法诱导其成为耐药菌株。采用PCR扩增和基因测序的方法,分析诱导耐药菌株的靶位基因gyrA和parC耐药决定区(QRDR)的基因突变情况。采用外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(PAβA)和实时荧光定量PCR方法探讨外排泵在体外耐药中的作用。【结果】采用体外浓度递增法可诱导大熊猫大肠埃希菌对3种氟喹诺酮类药物产生耐药性,其中环丙沙星最易产生耐药性,其次是麻保沙星,普多沙星相对较慢。普多沙星诱导的耐药菌首先在gyrA基因发生点突变,随着MIC的升高,靶基因突变位点也逐渐增多。环丙沙星和麻保沙星诱导的4株耐药菌的gyrA基因出现Ala 119Glu突变,而该突变在普多沙星所诱导的突变体中未发现。acrB,emrE和mdfA 3种外排泵基因在所有诱导的耐药菌株中均出现不同程度的过量表达,特别是在环丙沙星和麻保沙星诱导突变体中的表达明显高于在普多沙星诱导突变体中的表达。3种受试外排泵基因的表达均随MIC的升高而增加。【结论】普多沙星引起的大熊猫致病性大肠埃希菌多重耐药性,主要由靶基因的点突变和外排泵基因的过量表达所导致。     

鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮药物的主动外排作用

为研究鸭疫里默氏菌对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等氟喹诺酮类药物的主动外排机制,测定25株鸭疫里默氏菌临床分离株对氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度（M IC ）,同时测定加入主动外排抑制剂碳酰氰间氯苯腙（CCCP）后的MIC ,对二者进行比较分析。结果表明,对5种氟喹诺酮类药物耐药的鸭疫里默氏菌比例分别为84％、72％、76％、68％和36％;76％的菌株同时耐受2种及以上药物。CCCP可以使耐药菌对除左氧氟沙星外药物的敏感性增加,提示主动外排在鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制中发挥重要的作用。     

粉防己提取液对大肠埃希菌AcrAB-TolC外排泵调控基因的影响研究

目的:为考察粉防己提取液致耐药大肠埃希菌外排泵表达量的下降是否由其外排泵调控基因acrR和marR基因突变引起.方法:选取临床对喹诺酮类药物耐药性较强的大肠埃希菌菌株25-1,4-5,72-1,79和质控菌ATCC25922作为受试菌,用粉防己提取液进行处理,并分析其多重耐药抑制基因marR和acrAB外排泵抑制基因acrR的突变情况.结果:耐药大肠埃希菌在粉防己提取液处理后,乳酸环丙沙星对其MIC(Minimal Inhibitory Concentration)值明显降低,且其acrR和marR基因序列较处理前有多处明显突变.结论:中药粉防己提取液可能具有逆转大肠埃希菌喹诺酮类药物耐药性的作用.     

广州市售肉类食品源大肠埃希菌耐药性分析

【目的】了解广州市售肉类食品源大肠埃希菌的污染和耐药情况。【方法】自2011年7月至8月,从广州市各大农贸市场和超市采集市售肉类样品310份,其中猪肉253份,鸡肉57份。采用选择性培养基分离鉴定大肠埃希菌Escherichia coli,琼脂稀释法测定大肠埃希菌对19种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。【结果】310份样品中共分离到213株大肠埃希菌,分离率为68.7%,其中猪肉源177株,鸡肉源36株。受试菌株对复方新诺明、链霉素和四环素的耐药率超过75.0%,对氨苄西林、萘啶酸、氯霉素、新霉素、氟苯尼考、磷霉素、环丙沙星、安普霉素、恩诺沙星、庆大霉素和头孢唑啉的耐药率为10.0%~60.0%,而对头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶、黏菌素和阿米卡星表现较为敏感,耐药率小于5.0%。鸡肉源大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶和磷霉素的耐药率均高于猪肉源大肠埃希菌,差异极显著(P0.01)。213株大肠埃希菌中82.2%为多重耐药菌。【结论】广州市售肉类食品存在较为严重的多重耐药大肠埃希菌污染,且鸡肉源大肠埃希菌耐药性较猪肉源大肠埃希菌严重。     

大肠埃希氏细菌中ESBLs耐药质粒的传播与消除研究

【目的】研究大肠埃希氏细菌中超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)耐药质粒的传播及氯丙嗪对其的消除效果。【方法】采集河南开封和安阳疑似大肠埃希氏细菌病病死鸡、猪典型病料,经细菌学检验后,用试管二倍稀释法测定头孢噻呋和头孢曲松对致病性大肠埃希氏细菌的最小抑菌浓度(MIC),用双纸片协同法和PCR扩增法进行ESBLs检测。以安阳猪和开封鸡大肠埃希氏细菌作供体菌、DH5α为受体菌,进行ESBLs耐药质粒的接合传递试验。用氯丙嗪作消除剂,以SDS为对照,对大肠埃希氏细菌分离株ESBLs耐药质粒进行消除试验。【结果】从疑似大肠埃希氏细菌典型病料中分离到了大肠埃希氏细菌;头孢噻呋和头孢曲松对分离菌株的最小抑菌浓度分别为32~64和64~128μg/mL;检测到了ESBLs耐药质粒的存在,且其能在大肠埃希氏细菌间传播,氯丙嗪对其第12次的消除率高达98.83%。【结论】ESBLs耐药质粒可通过接合转移方式传递至感受态大肠埃希氏细菌中,氯丙嗪对其消除效果很好。     

猪、鸡大肠杆菌ESBLs的基因型检测

【目的】检测致病性大肠埃希氏菌中超广谱β-内酰胺酶(Extendβ-lactamase,ESBLs)的基因型,指导兽医临床合理用药。【方法】对产生ESBL的5株致病性大肠埃希氏菌,设计并合成TEM-1和SHV-1两对引物,用PCR方法进行了ESBLs耐药质粒的DNA扩增、测序和基因型分析【结果】以产生ESBLs细菌的ESBLs耐药质粒为模板均扩增出了与预期片段大小相符的TEM型ESBL产物,但都没有扩出SHV型ESBL产物。【结论】结果提示国内畜禽产生ESBLs的致病性大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换;ESBLs的产生与动物种属没有关系;为克服细菌的该类耐药性问题,应该进行头孢噻呋复方制剂的研究。     

猪源大肠埃希菌喹诺酮类耐药基因的检测及分析

【目的】探究江苏泰州地区猪源致病性大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药情况以及喹诺酮相关耐药因子的流行情况.【方法】采用纸片法对81株临床分离的猪源致病性大肠埃希菌进行喹诺酮类药物耐药性的检测,通过PCR方法检测质粒介导的喹诺酮类耐药基因(PMQR)和喹诺酮类耐药决定区基因(QRDR)并进行分析.【结果】菌株对萘啶酸和环丙沙星的耐药最为严重,耐药率分别为69.1%和51.9%,且多呈现多药耐药现象.PMQR检测结果表明aac(6′)-Ib-cr基因检出率最高,为76.5%,其次为qnrS,qnrA,qnrD,qnrB,检出率依次为45.7%,34.6%,23.6%,2.5%,未检出qepA基因.QRDR突变分析中,常见的gyrA中Ser83突变为Ile, Asp87突变为Asn或Gly和parC中Ser80突变为Ile均被检测到,突变率分别为84.0%,61.7%和60.5%.而gyrB中Asp426突变为Gly还是首次报道,突变率为35.8%.此外,parC还检测到1株Phe64突变为Pro,2株Gln91突变为His.【结论】江苏泰州地区猪源大肠埃希菌中PMQR基因普遍存在,且QRDR基因突变严重,提示应加强抗生素的合理使用以及对喹诺酮相关耐药基因的监控.     

体外诱导嗜水气单胞菌对喹诺酮类耐药及其耐药机制研究

【目的】探讨在亚抑菌浓度喹诺酮类药物培养后,嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila对喹诺酮类的药物敏感性变化及其耐药机制.【方法】以对喹诺酮类敏感的临床分离嗜水气单胞菌菌株和标准菌ATCC7966为研究对象,分别在含亚抑菌浓度萘啶酸(NAL)和环丙沙星(CIP)的培养基上逐步诱导培养.提取诱导菌的DNA,PCR扩增其gryA和parC基因,测序分析其喹诺酮类耐药决定区(QRDR)突变情况;测定诱导菌对诱导药物和11种非诱导药物的最小抑菌浓度(MIC)及添加外排泵抑制剂羰基氰化氯苯腙(CCCP)后的MIC,分析其敏感性变化与基因突变、外排作用的关系.【结果和结论】诱导后菌株对萘啶酸和环丙沙星的MIC分别提高了1 024和64 000倍,对非诱导药物也有不同程度提高;当萘啶酸和环丙沙星诱导浓度分别达到16和32μg/mL或以上后,诱导菌株gyrA基因编码的氨基酸分别发生Asp87→Tyr和Ser83→Arg的变化,但两者parC基因编码的氨基酸均没有发生突变;添加CCCP后,只有氟喹诺酮类药物的MIC值略有下降,提示嗜水气单胞菌对喹诺酮类耐药存在靶基因突变及主动外排作用等多种耐药机制.     

致病性大肠埃希氏菌ESBLs基因型的检测及其抑制剂的抑酶保护作用

【目的】检测致病性大肠埃希氏菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型,初步研究β-内酰胺酶抑制剂(BLI)-他唑巴坦的抑酶保护作用。【方法】对产生ESBLs的5株致病性大肠埃希氏菌,设计并合成TEM-1和是SHV-12对引物,用PCR方法进行了ESBLs的DNA扩增、测序和基因型分析;用试管二倍稀释法测定头孢噻呋与BLI-他唑巴坦钠以不同配比对产生ESBLs大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度。【结果】从产生ESBLs细菌中均扩增出了TEM型ESBLs产物,但未扩增出SHV型ESBLs产物;头孢噻呋与BLI-他唑巴坦钠(质量比1∶1～8∶1)联合使用,对产生ESBLs的大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度较头孢噻呋单独使用基本降低,最高可降低16倍。【结论】国内畜禽产生ESBLs的大肠埃希氏菌未通过质粒进行细菌间耐药基因的交换,ESBLs的产生与生物种属没有关系,BLI-他唑巴坦有较强的抑制ESBLs作用。     

腹泻犬源大肠埃希菌耐药性以及整合子–基因盒检测研究

【目的】了解腹泻犬源大肠埃希菌Escherichia coli的耐药性以及整合子携带情况。【方法】采用K-B纸片扩散法对30株分离自腹泻犬的大肠埃希菌进行19种抗菌药物的敏感性试验;PCR检测菌株中是否携带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合酶基因,对携带有整合酶基因的阳性菌株进一步检测sul1、qac EΔ1基因以及可变区基因盒携带情况。【结果】30株分离株对19种抗菌药物表现出不同程度的耐药性,共产生18种耐药谱,对阿莫西林、氨苄西林、四环素和多西环素的耐药性较高,耐药率分别为90.00%、83.33%、66.67%和63.33%;对其余药物耐药性较低,耐药率低于14.00%;11株分离株含有Ⅰ型整合酶基因且均携带sul1和qacEΔ1基因,未检出Ⅱ型和Ⅲ型整合酶基因;Ⅰ型整合子阳性菌株中,有2株扩增出1 879 bp的耐药基因盒:dfrA12+orfF+aadA2。【结论】本次检测的腹泻犬源大肠埃希菌对抗菌药物呈不同水平的耐药性;基因盒介导的耐药性与菌株的耐药表型存在部分相关性,大肠埃希菌的耐药性与Ⅰ型整合子存在一定关系。     

AcrAB Efflux Pump in Fluoroquinolone Resistant Salmonella gallinarum Induced by Ciprofloxacin Selective Pressure

Salmonella gallinarum has shown multiple drug resistance (MDR),especially high level fluoroquinolone (FQ) resistance in recent years.To determine whether the active efflux system was responsible for high-level FQ resistance,this research studied AcrAB efflux pump in Salmonella gallinarum on molecular level.The resistant strains were induced by standard strain C79-13 with ciprofloxacin in vitro.With carbonylcyanide-p-chlorophenyl hydrazone (CCCP) as an energy inhibitor,efflux inhibition test initially showed the potential impact of efflux pump on drug resistance.Sequence analysis of acrA gene indicated that gene mutation of AcrAB efflux pump was not definitely associated with MDR and drug resistance level of Salmonella gallinarum.Detected by competitive RT-PCR,the mRNA expression of acrA and acrB genes in the resistant strains significantly increased (p0.01) compared with that of the control strain C79-13.The mRNA expression level of acrB gene (increased from 1.6-to 2.9-folds) was consistent with that of acrA gene (increased from 1.6-to 2.8-folds),which increased with the drug resistance level.However,gene mutation of acrA gene showed no correlation with its mRNA expression level,indicating that gene mutation did not affect the expression of AcrAB pump itself.The results suggested that the overexpression rather than the gene mutation of AcrAB efflux pump was an important factor causing the high level drug resistance of Salmonella gallinarum.     

动物、环境及饲养员多重耐药大肠杆菌的PFGE分型研究

【目的】了解养殖场多重耐药大肠杆菌耐药性的传播机制，探讨人、动物与环境间耐药菌垂直克隆传播的可能性。【方法】采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法对分离自养殖场动物、环境和饲养员的86株耐药谱相近多重耐药大肠杆菌进行DNA指纹图谱分型，比较菌株之间的亲缘关系。【结果】37株鸡场来源大肠杆菌可分为20种PFGE分型；49株猪场来源大肠杆菌可分为24种PFGE分型；同一动物、环境或饲养员采样点分离菌株PFGE指纹图谱相同者较多；同一养殖场不同动物个体、养殖场环境不同采样点、动物和环境以及饲养员和环境都存在PFGE指纹图谱完全相同菌株；鸡场和猪场都发现有属同一PFGE分型的来自动物、饲养员和环境的菌株；86株菌全部对环丙沙星、氨苄西林、链霉素、四环素、多西环素和复方新诺明耐药，相同PFGE分型的菌株其耐药谱型不一定相同。【结论】养殖场动物、环境及饲养员之间存在多重耐药大肠杆菌的克隆传播。     

广西猪源致病性大肠杆菌对抗菌药物 的耐药性变化分析

[目的]分析2007和2016年广西猪源致病性大肠杆菌对抗菌药物的耐药性差异,为兽医临床用药防治猪大肠杆菌病提供参考依据.[方法]2016年初从广西25个猪场采集腹泻仔猪的肠内容物、直肠棉拭子或肠系膜淋巴结等200份样品,分离大肠杆菌后进行致病力试验,选取103株致病性大肠杆菌用于体外药敏试验,将药敏试验结果与2007年的相关结果进行对比分析.[结果]从腹泻仔猪的体内共分离获得大肠杆菌178株,分离率为89%,其中有143株大肠杆菌可致试验小鼠死亡.与2007年相比,2016年广西猪源致病性大肠杆菌对50%的抗菌药物(9种)的敏感率上升,50%的抗菌药物的敏感率下降,上升最明显的为壮观霉素,升高34.9%,下降最明显的为氟苯尼考,降低46.9%;除头孢曲松和强力霉素的中介率与2007年相比基本无变化外,其余16种抗菌药物的中介率均降低,最明显的为头孢拉啶,降低55.2%;耐药率降低的抗菌药物只有阿米卡星、壮观霉素和强力霉素3种,降低12.3%~15.5%,耐药率升高的抗菌药物有15种,上升率为1.2%~62.1%,其中阿莫西林上升62.1%,氟苯尼考上升57.0%.耐药谱方面,2007年以5~11重耐药为主,占受试菌总数的75.7%,2016年以11重耐药以上为主,占74.8%.[结论]当前广西猪源致病性大肠杆菌以广谱耐药为主,敏感性降低,中介率降低,耐药率明显升高,生产中可选用阿米卡星和壮观霉素进行猪大肠杆菌病防治.     

泵抑制剂对诱导产ESBLs鸡大肠杆菌抗菌药物敏感性的影响

目的:探讨头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻呋诱导鸡源大肠杆菌耐药产ESBLs与主动外排机制的关系。方法:用头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻呋诱导3株临床分离菌和标准菌O78至产ESBLs;采用琼脂二倍稀释法观察外排泵抑制剂利血平和CCCP对诱导菌抗菌药物敏感性的影响。结果:加入利血平后,头孢曲松诱导后的菌株,阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素组的MIC值变化有统计学差异,耐药率下降范围为25%～75%;头孢噻肟诱导后的菌株,头孢曲松、头孢噻呋、多西环素、氟苯尼考、磷霉素组MIC值变化有统计学差异,耐药率下降为25%～100%;头孢噻呋诱导后的菌株,其中头孢曲松、头孢噻呋、阿米卡星、氟苯尼考、磷霉素有统计学差异,耐药率下降为25%～100%。加入CCCP以后,仅头孢噻肟诱导后的菌株,头孢曲松MIC值变化差异显著;头孢噻呋诱导的菌株,头孢曲松、氟苯尼考差异显著;且耐药率下降范围均为25%～75%;利血平与抗菌药物合用后对诱导菌抗菌药物敏感性的影响高于CCCP。结论:3种头孢类药物诱导后的菌株对10种抗菌药物的外排表型存在差异;鸡大肠杆菌特异性耐药机制ESBLs可激活非特异性耐药机制外排表型的过度表达。     

耐药猪链球菌膜蛋白图谱分析及能量抑制剂对其敏感性的影响

为证实国内临床分离的动物源链球菌菌株中是否存在与红霉素耐药性相关的主动外排机制,选取含有mefA基因和ermB基因和不含mefA/ermB基因的链球菌耐药菌株和青霉素、红霉素均敏感菌株,在能量抑制剂氰氯苯腙(CCCP)存在时,采用棋盘法分析红霉素、阿齐霉素、替米考星、青霉素对分离菌MIC的影响,并采用SDS-PAGE电泳分析分离株的膜蛋白图谱.结果显示:CCCP可对含有mefA基因的耐药菌株产生影响,可增强其对红霉素、阿齐霉素的敏感性,但不影响其对替米考星和青霉素的敏感性.含有ermB基因、不含mefA/ermB基因的耐药菌,对红霉素、阿齐霉素、替米考星和青霉素的敏感性不受CCCP的影响.菌株膜蛋白的SDS-PAGE电泳图谱显示,含有mefA基因的耐药菌株与其他菌株的膜蛋白图谱差异较大,其膜蛋白条带多而深浓,在45 000处有明显的条带,其他菌株无该条带,推测该蛋白可能是膜主动外排的相关蛋白.本试验结果佐证了在链球菌内存在与红霉素耐药相关的主动外排机制.     

六茜素的药效学和急性毒性研究

[目的]分析测定六茜素的药效学及急性毒性。[方法]利用药敏试验、体内抑菌试验测定六茜素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等6种细菌的药效学,灌胃法测定六茜素对动物模型的急性毒性。[结果]六茜素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等6种细菌均具有良好的抑菌效果,其抑菌效果优于青霉素、庆大霉素;六茜素对大肠杆菌、绿脓杆菌感染的动物模型的治疗效果显著,治疗率均为100%,且优于环丙沙星对绿脓杆菌动物感染模型的疗效;六茜素对小白鼠的最小致死(MLD)剂量为400 mg/kg,半数致死(LD50)剂量为513.25 mg/kg。[结论]分析测定了六茜素的药效学和急性毒性,为进一步临床应用六茜素治疗动物疾病奠定基础。     

猪源致病性大肠杆菌的血清型、毒力基因及抗菌药耐药性的调查

【目的】探讨猪大肠杆菌病分离的E.coli的优势血清型与毒力基因和耐药性的相关性。【方法】采用玻片凝集法测定了猪大肠杆菌病有关的血清型分布,PCR方法调查7种毒力相关基因,用微量稀释法测定了所有菌株对18种抗菌药的敏感性。【结果】超过一半的菌株含有astA,Stx2e和eaeA基因,且毒力基因组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行。定型菌株53株,分别属于15个不同的血清型,其中O8和O64为主要流行的血清型。O8型菌株中,所有均携带astA基因,多数耐四环素、环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑,但对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感;而O64型菌株中,多数携带astA和Stx2e基因,所有对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和磺胺甲噁唑耐药,但对多黏菌素E和卡那霉素敏感。【结论】O8和O64为主要流行的血清型,两种血清型菌株拥有相似的毒力基因谱和耐药表型,但有不同的敏感表型。     

临床分离大肠杆菌磺胺敏感性及磺胺抗性相关基因的检测

对分离自中国东北牛(n=181)、猪(n=182)、鸡(n=146)和鹌鹑(n=55)的粪便及病变器官的564株大肠杆菌菌株进行磺胺敏感性与磺胺抗性基因检测。分别用肉汤微量稀释法和聚合酶链式反应检测磺胺敏感性和磺胺抗性基因。结果表明:在564株菌株中,235(41.7%)株对磺胺试剂敏感,329(58.3%)株对磺胺甲恶唑有抗性,190(33.7%)株对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑有抗性;不同动物分离株的磺胺抗性比例不同,从牛、猪、鸡和鹌鹑中分离到的菌株int1基因的比例分别是12.2%、44.5%、40.4%、18.2%,sul1基因比例分别是5.5%、37.4%、28.1%、3.6%,sul2基因比例分别是39.2%、25.3%、29.5%、10.9%,但在牛、鸡、鹌鹑源菌株中未检测到sul3基因,在182株猪源大肠杆菌中检测到13株(7.1%)sul3基因阳性菌株。菌株的磺胺抗性与其包含的抗性基因之间不完全吻合。