马立克氏病毒感染致鸡胚成纤维细胞4号染色体上微卫星不稳定性研究

应用微卫星技术对感染马立克氏病毒5 d后的32个鸡胚成纤维细胞(CEF)4号染色体上的20个微卫星标记进行PCR扩增,扩增产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染检测.试验结果显示:20个微卫星标记有18个表现出不同程度的微卫星不稳定性,其中ABR0622发生率最高,为37.50%;MCW0174、ADL0266和ABR0382的发生率较高,均为31.25%.在32组样品中有30个检测到微卫星不稳定性,其中11号样品发生率最高,为45.00%,其次是3号样品为35.00%.结论:CEF感染马立克氏病毒后出现微卫星不稳定性现象.     

人参皂苷及其衍生物体外抗MDV的作用

通过透射电子显微镜观察人参皂苷及其衍生物对马立克氏病毒(MDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的保护效果,探讨人参皂苷及其衍生物体外抗马立克氏病毒的作用机理。结果表明,人参皂苷及其衍生物均具有较好的抗病毒作用,可以减轻病毒对鸡胚成纤维细胞的损伤程度。     

突变型抑癌基因p53在鸡马立克氏病肿瘤组织中的表达研究

[目的]探讨抑癌基因p53在鸡马立克氏病的发生与发展中的作用和意义。[方法]采用免疫组织化学和细胞化学技术,观察抑癌基因p53在鸡马立克氏病肿瘤组织及体外培养感染马立克病毒的鸡胚成纤维细胞中的表达。[结果]在体外培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)感染马立克氏病毒后,感染的CEF呈阳性。在马立克氏病的发生过程中,突变型抑癌基因p53在病鸡的肝脏、肾脏、肿瘤、心脏、脾脏、肺脏、胸腺及法氏囊中均可检出中等量的表达。p53发生突变时所产生的p53蛋白突变体的半衰期比未发生突变时要长。[结论]突变型p53基因具有直接转化细胞和阻碍野生型p53发挥作用的特点,致使突变的DNA得以积累,最终导致癌变的发生。     

表达马立克氏病病毒gI基因重组鸡痘病毒的免疫原性

以鸡痘病毒为载体，构建含马立克氏病病毒（MDV）gI基因的重组鸡痘病毒（rFPV)，并在鸡胚成纤维细胞（CEF）中表达gI基因，用重组FPV（命名为rFPV-MDV648gI）感染CEF，结果显示：rFPV-MDV648gI能在CEF中稳定复制。进一步用rFPV-MDV648gI接种无特定病原（SPF）鸡皮下组织，结果表明：鸡对rFPV-MDV648gI具有抗体反应性。     

爆发鸡马立克氏病后部分微卫星不稳定性的研究

选取45个微卫星位点,对爆发马立克氏病的4只患鸡的淋巴细胞和正常的组织及3号鸡的肿瘤组织,提取核酸,利用45个所选微卫星引物进行PCR扩增,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测微卫星不稳定性的变化。研究结果表明,在4只患鸡中有39个微卫星位点发生微卫星不稳定性的变化,其中3号鸡发生变化概率最高,证实同个体的淋巴细胞和肿瘤组织同位点发生MSI变化的符合率达到75.6%。     

马立克氏病毒DNA转录区和非转录区甲基化及脱甲基化的探讨

实验以鸡马立克氏病脾脏淋巴瘤继代细胞系MDCC MSB 1和感染马立克氏病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)为主要试验材料,作为参考系也使用了鸡马立克氏病卵巢淋巴瘤继代细胞系MDCC JP1、MDCC JP2、MDCC HP1及MDCC HP2细胞。用Suothern斑点分子杂交放射自显影等方法,验证了MDCC MSB 1等细胞株DNA的转录区和非转录区都存在着甲基化现象。转录区甲基化程度高于非转录区。用5 氮胞苷可以阻断DNA甲基化,阻断效果在转录区最好。     

表达马立克氏病病毒gI基因的重组鸡痘病毒的构建

以马立克氏病病毒 (MDV) 648株基因组DNA为模板 ,用PCR方法扩增 gI基因 ,将其插入到鸡痘病毒转移载体pFG1 1 75 1 ,通过脂质体方法转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,用蓝斑筛选方法纯化 4次 ,得到重组FPV ,用PCR方法证实 gI已插入到FPV基因组中 ,以间接免疫荧光试验鉴定重组FPV在CEF中表达了 gI基因 ,重组FPV命名为rFPVMDV648gI。     

利用雉鸡胚成纤维细胞制造鸡马立克氏病疫苗的研制与应用

采用经检测无鸡新城疫、鸡痘、鸡马立克氏病、鸡支原体、鸡沙门氏菌、禽白血病等致病性微生物感染的11日龄雉鸡胚、10日龄普通京白鸡胚以及SPF胚制成鸡胚成纤维细胞，然后接种火鸡疱疹病毒(HVTFc-126)制成冻干疫苗各50万羽份。将以上3种鸡胚疫苗同时进行蚀斑计数、特异性检测和安全检验，发现除普通鸡胚苗轻度污染外源病毒外，其它各项检验均符合标准，而且雉鸡胚苗保护率高于普通京白鸡胚苗20％以上，低于SPF胚苗10％左右。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白I原核表达产物单克隆抗体的制备

以重组质粒 p GEX-MDg I在大肠杆菌 BL2 1中表达马立克氏病病毒 (MDV)特超强毒 64 8A株的囊膜糖蛋白 I(g I)完整基因 ,通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离相应的蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原免疫小鼠 ,用以制备针对MDV64 8A g I糖蛋白的杂交瘤细胞株。以 MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)为检测抗原 ,用间接免疫荧光抗体反应(IFA)筛选到 9株杂交瘤细胞株 ,选其中 3株 2 H7、6F1 0、2 H3制备腹水 ,其 IFA效价均达到 1∶ 1 50 0以上 ;与 I型 MDV不同致病型的毒株 CVI988/ Rispens、GA、RB1 B、Md1 1株感染的 CEF测 IFA,均呈现特异性荧光 ,但反应强度不同。腹水经 PBS稀释后与 MDV感染的 CEF做斑点酶联免疫吸附试验 ,呈特异性显色。对 MDV感染的 CEF裂解物做 West-ern-blotting,可检测出 1条特异性条带     

异羟基洋地黄毒甙元核酸探针对马立克氏病毒DNA的检测

应用异羟基泣地黄毒甙元标记的ＤＮＡ探针，检测了细胞培养物和鸡羽髓中提取的马立克氏病毒核酸。结果发现，异羟基洋地黄毒甙元标记的马立克氏病毒血清Ⅰ型（ＧＡ株）核酸的ＢａｍＨＩ－Ｌ片段探针，只与马立克氏病毒Ⅰ型核酸发生杂交，而不与Ⅱ型（ＳＢ－１）或Ⅲ型（ＨＶＴ）发生杂交。对３６份鸡羽髓病料提取的病毒核酸的杂交检测与琼扩试验相比较，前阳性率为９４．４％。后仅为８６．１％。由此说明，Ⅰ型病毒的核酸探针可     

放疗后复发鼻咽癌微卫星不稳定和杂合性缺失改变的研究

目的比较放疗后复发鼻咽癌（NPC）与初诊NPC中染色体微卫星不稳定（MSI）和杂合性缺失（LOH）发生情况。方法选择1p、3p、3q、4q、9q、11q、13q、14q的12个微卫星多态性位点,显微切割分离22例初诊和18例放疗后复发NPC组织和正常组织,提取DNA,经PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色,进行MSI及LOH分析研究。结果（1）8个位点发生了LOH：复发癌与初诊癌相比,LOH发生率在D1S2697位点为28.6%比20.0%,在D13S133位点为30.0%比20.0%,在D9S1682位点为7.7%比9.1%;D5S433和D14S65位点只在复发癌中发生LOH,分别为33.3%和6.7%;D13S263、D4S350、D14S258位点只在初诊癌发生LOH,分别为20.0%、33.3%、16.6%。（2）11个位点发生了MSI：4个位点在复发癌和初诊癌中都发生MSI,4个位点只在复发癌中发生MSI,3个位点只在初诊癌中发生MSI。结论 D1S2697、D13S133、D5S433位点可能含有与放疗后复发NPC相关的肿瘤抑制基因,放疗后复发NPC中MSI发生率呈增高趋势,提示部分放疗后复发NPC与原发癌可能属不同细胞克隆起源。     

哮喘患者12号染色体微卫星不稳定性和杂合性丢失的研究

目的了解广东湛江地区哮喘患者12号染色体微卫星不稳定性（microsatellite instability,MSI）及杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）情况。方法采用PCR、聚丙烯凝胶电泳及硝酸银染色法对30例哮喘患者和30例健康对照者外周血及痰液DNA中12q13.11-24.31上10个微卫星位点进行检测。结果健康对照者未发现任何微卫星改变现象。30例哮喘患者中,8例（26.7%）患者痰液DNA有一个或多个位点发生微卫星改变（包括MSI和LOH）。结论湛江地区哮喘患者痰液DNA中12号染色体上可检测到MSI和LOH现象。微卫星改变可能与哮喘之间存在一定的相关性,MSI和LOH可能在哮喘发病机制中起一定的作用。     

短毛切梢小蠹微卫星富集文库的构建与分析

采用生物素-磁珠富集法,构建短毛切梢小蠹微卫星富集文库。在该文库中随机挑选100个克隆作测序分析,结果表明：具微卫星位点的克隆占91％;具有10次以上碱基重复次数的微卫星序列占36％,其中最高碱基重复次数为63次;在这些微卫星序列中,完美型占47．3％,非完美型占24．2％,混合型占16．5％。表明获得的微卫星文库是高质量的文库,完美型的比例高于不完美型和混合型,与真核生物微卫星序列特征相符。     

Analysis on Quantitative Trait Loci for Resistance to Rice False Smut under Different Environmental Conditions

利用157个家系组成的大关稻（japonica）/IR28（indica）重组自交系（Recombinant inbred lines,RIL）群体,采用高效引发稻曲病人工接种方法,以病情指数作为稻曲病的表型值。在南京、扬州分别鉴定了亲本及 RILs对水稻稻曲病的抗性。利用 QTL Cartographer 软件,对水稻稻曲病抗性基因进行检测分析。两个环境下共检测到 qFsr1、qFsr2、qFsr4、qFsr8、qFsr10a、qFsr10b、qFsr11、qFsr12等8个 QTL,分别位于第1、2、4、8、10、11和12染色体上,贡献率在8.6%~22.5%之间。其中,南京检测到qFsr1、qFsr4、qFsr10a、qFsr11、qFsr12等5个位点;扬州检测到 qFsr2、qFsr8、qFsr10a、qFsr10b、qFsr11等5个位点,qFsr10a、qFsr11在两个环境下中均被检测到,对性状的解释率在18.0%~18.9%之间,使病情指数下降8.0%~14.6%,提高了抗病性。根据抗性位点加性效应方向,在qFsr1、qFsr2、qFsr8、qFsr10a、qFsr11和qFsr12位点上,亲本 IR28存在抗稻曲病的增效等位基因,大关稻具有减效等位基因,而位点 qFsr4、qFsr10b的抗性效应来源正好相反。 qFsr10a、qFsr11及其附近的标记可望在稻曲病抗性分子标记辅助选择育种中加以应用。     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDV1细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，用X-gal染色,挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphⅠ和NheⅠ双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS-BGS。将该载体用NheⅠ线性化后，用脂质体转染已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，X-gal染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有E.coli F因子以及两同向的loxP位点的MDV1转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDV1细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDVI）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDVI细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含EcoliF因子的马立克氏病病毒I型（MDVI）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有EcoliF因子的马立克氏病病毒I型（MDVI）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用Mx—HAT药物筛选3代以后，用x—gal染色，挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphI和NheI双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS—BGS。将该载体用NheI线性化后，用脂质体转染已感染cVI988病毒的CEF，用MX—HAT药物筛选3代以后，x—gaI染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有Ecol／F因子以及两同向的loxP位点的MDVI转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDVI细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

凡纳滨对虾3个亲本及其子代群体的SSR分析（摘要）（英文）

利用微卫星标记技术,采用8对微卫星引物对凡纳滨对虾3个亲本群体（OI Q、SIS Q、Kona Bay Q）及其子一代（OI Z、SIS Z、Kona BayZ）共计120个个体进行遗传分析。计算6个群体在8个微卫星位点上的平均等位基因数（Na）、平均有效等位基因数（Ne）、平均观测杂合度（Ho）、平均期望杂合度（He）、平均多态信息含量（PIC）和平均Hardy-Weinberg平衡指数（D）,以上各参数均采用群体遗传学分析软件POP-GENE3.2处理,同时根据Nei的方法计算群体间的遗传距离和遗传相似系数。运用MEGA3.0软件,采取UPGMA方法根据6个群体的遗传距离进行聚类。结果表明：8对微卫星引物在6个群体中共检测到28个等位基因,每个位点的等位基因数为2 ～6个,平均等位基因数为3.5;各位点的期望杂合度均比观测杂合度高;多态信息含量（PIC）值为0.479 4 ～0.769 9,说明这8个位点在凡纳滨对虾中具有较高的信息含量。在亲本和子代群体遗传结构分析中,子代的有效等位基因数、杂合度和多态信息含量等指标均略低于亲本群体,但子代的遗传多样性并未受到太大影响,仍保持较好的遗传力。     

转化型人参皂苷抗MDV及诱导肿瘤细胞凋亡的作用初探

以转化型人参皂苷的8个组,按12.5μg·mL-1的剂量,在体外鸡胚成纤维细胞上进行抗MDV-RB1B强毒株空斑减数试验和诱导肝癌7402细胞株、大鼠脑胶质瘤细胞C6株细胞凋亡试验,用光学显微镜观察、琼脂糖凝胶电泳检测分析DNA损伤。结果表明:转化型人参皂苷6、7号组,在感染阻断、增殖抑制、直接杀灭3种方式的抗MDV空斑减数率都达到阿昔洛韦(ACV)抗MDV空斑减数率的80%,转化型人参皂苷4、6号组对MDV-RB1B株的直接杀灭作用与ACV的杀灭作用相同;转化型人参皂苷8号组诱导肝癌7402株细胞48h后,有60%的瘤细胞凋亡,对大鼠脑胶质瘤C6株细胞也有诱导凋亡的作用。     

红原鸡基因组序列中两段染色体未知序列的连锁定位

利用来杭鸡的蛋壳强系和弱系的F2代进行蛋壳强度相关QTL分析时，绘制了相应的连锁图谱。经过连锁分析，发现微卫星标记ABR362和ABR424分别与染色体已知的标记相连锁，分别位于1号和9号染色体。而在已经公布的红原鸡基因组序列中，这2个标记的PCR产物序列染色体尚未定位。通过连锁关系分析，这2段序列也分别定位于红原鸡1号和9号染色体上。