杏离体胚培养与超低温保存的研究

使用包埋玻璃化法对杏离体胚进行超低温保存研究,探讨适宜培养基、蔗糖预处理的时间及浓度、玻璃化保护液的选择及时间对超低温保存后胚成活率的影响。结果表明,胚在0.8 mol/L的蔗糖溶液中预培养24 h后,转入玻璃化保护液B中继续培养30 min ,投入液氮24 h后用40℃水浴快速化冻5 min ,转入MS培养基中在22℃条件下进行暗养,1 d后转移光照培养,最高成活率达80%。     

绵羊成熟卵母细胞GMP玻璃化冷冻影响发育因素的研究

利用GMP法(毛细玻璃管法)冷冻成熟的绵羊卵母细胞,旨在探讨冷冻和解冻处理方法对绵羊成熟卵母细胞发育潜力的影响.对比在玻璃化冷冻液中添加0.3 mol/L蔗糖;卵母细胞冷冻前用7.5 μg/ml CB预处理;卵母细胞去掉颗粒细胞冷冻;以及四步法解冻和三步法解冻对卵母细胞形态完整率、孤雌激活胚发育率的影响.结果显示:玻璃化冷冻液中添加蔗糖孤雌激活卵裂率达到56.70%,极显著高于对照25.40%(P<0.01),桑葚胚率(16.49%)比对照(4.76%)有明显提高(P<0.05);冷冻前用CB进行预处理,解冻后形态正常率为78.78%,明显高于对照61.11%(P<0.05),孤雌激活卵裂率(39.39%)也高于对照组(21.11%);去掉颗粒细胞裸卵与保留颗粒细胞成熟卵母细胞解冻后形态正常率、孤雌激活卵裂率及桑葚胚率、囊胚率之间无显著性差异(P>0.05);四步法解冻和三步法解冻后卵母细胞形态恢复及孤雌激活后的发育率,两组之间差异不显著(P>0.05).在玻璃化冷冻液中添加蔗糖及卵母细胞冷冻前用CB预处理有利于卵母细胞冷冻解冻后形态恢复及孤雌激活后的胚胎发育.     

自制简易胚胎冷冻器冷冻奶牛胚胎试验

用FSH+PGF_(2)超排黑白花奶牛,以非手术方法采得7日龄早期胚胎。应用含10％甘油卵细胞培养液作为胚胎冷冻保护液,采用自制简易胚胎冷冻器冷冻,在-196℃液氮中保存。冻胚在35℃水浴中解冻,应用92.1g/L甘油+171.2g/L蔗糖PBSS,46g/L甘油+171.2g/L蔗糖PBSS和171.2g/L蔗糖PBSS三步脱去甘油,用含20％犊牛血清PBS将胚胎清洗2遍后装管移植。共解冻18枝冻胚,16枚可用。可用胚率为84.2％(16/18)。采用非手术方法移植16头受体牛,5头妊娠产犊,移植妊娠率为31.5％(5/16)。     

杂交兰种苗超低温脱毒技术研究

以携带建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的杂交兰根状茎为试材,采用包埋玻璃化超低温保存法对杂交兰病毒脱除进行研究。结果表明：低温炼苗21 d的茎尖,在0.5 mol/L的蔗糖浓度预培养基中培养3 d,然后浸入0.4 mol/L高糖液体培养基中加载90 min,之后转入玻璃化溶液PVS2(protect vitrification solution 2)中冰上处理6 h,再液氮保存1 h,最后于37℃水浴中解冻2~3 min,1.2 mol/L高糖液体培养基中卸载20 min,待恢复培养后,杂交兰茎尖成活率为64%以上,随机检测30个样品,两种病毒脱毒率均为100%。研究为杂交兰种苗脱毒奠定了一定的理论基础。     

扁桃休眠茎尖包埋玻璃化超低温保存的初探

[目的]研究包埋玻璃化法对扁桃休眠茎尖超低温保存的影响,为扁桃资源的超低温保存提供理论依据.[方法]采用不同预培养蔗糖浓度和预培养时间、不同装载液处理时间、不同玻璃化液处理时间及不同化冻方式对莎车14号扁桃休眠茎尖包埋玻璃化超低温保存存活率进行比较.[结果]将低温贮藏的扁桃休眠茎尖剥成1～2 mm,用3;的海藻酸钠包埋,在含0.4 mol/L蔗糖的0.1 mol/L CaCl2溶液中固定30 min后形成包埋丸,用含有0.5 mg/L蔗糖的MS培养基预培养3d,放入装载液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖)中处理20 min,0℃下用PVS2处理30 min后迅速投入液氮,超低温保存24 h后取出,放入40℃水浴锅中化冻1～2 min,用1.2 mg/L蔗糖的MS洗涤液洗涤20 min,转入含0.3 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IAA的MS培养基中培养,存活率达45;.[结论]包埋玻璃化法能够提高莎车14号扁桃休眠茎尖超低温保存的存活率.     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

小鼠半胚冷冻的研究

对半胚冷冻的方法和条件进行了系统研究,证明采用下述程序冷冻小鼠半胚可显著提高解冻半胚的成活率:①在含10％甘油的磷酸缓冲液中平衡35～40min;②在-6.5℃或-7℃诱发结晶,③以0.05℃/min的速度缓慢降温15min;④以0.3℃/min的速度降温至-35℃投入液氮;⑤在30～35℃的水浴中解冻;⑥在含不同浓度(6.6％,3.3％,0％)甘油和0.3mol/L蔗糖的磷酸缓冲液中平衡35～40min,去除甘油。将按上述程序冷冻—解冻的16对半胚移植后,获半胚鼠12只,其中5对为同卵双生。     

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L FBS相     

低温速冻实现肉品部分玻璃化工艺探讨

试验以汁液流失为主要测试指标，以液氮为制冷工质，在不同降温速度（10℃/min,5℃/min,1℃/min,及0．1℃／min)下，将不同形状的牛肉冻至不同终温（－80℃，－60℃，－40℃，－20℃），然后用自然解冻和冷藏室解冻方法升温至0℃。结果表明，以10℃/min的速率快速降温至肉品玻璃化转变温度－60℃左右范围，可有效地减少汁液流失。相同冻结工艺条件下，形状较小的肉品汁液流失较形状较大者多；对于实现部分玻璃化的肉品，自然解冻比冷藏室解冻汁液流失少。说明液氮快速深冷冻结比普通冻结有利于实现肉品部分玻璃化状态，适当的解冻方式可避免重结晶，从而有效地减少汁液流失量，改善冷冻食品的品质。     

紫参薯的包埋玻璃化超低温保存

以紫参薯带芽茎段为材料,采用2%海藻酸钠和0.1mol/L氯化钙凝胶系统制备包埋珠,液氮保存,以茎段细胞活力和包埋珠成活率为指标筛选获得有关参数适宜水平,比较冻后再生苗与常温苗形态及生理指标.结果表明:紫参薯试管苗经4℃锻炼6d后,无菌条件下制备其带芽茎段包埋珠,接种到MS+2 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+0.5mol/L蔗糖液体培养基中预培养1d,转入MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖溶液中室温下装载40min,在玻璃化保护剂PVS2中脱水40min,更新PVS2后迅即液氮保存,24h后置于37℃水浴中化冻5min,用MS+2mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.8mol/L蔗糖溶液洗涤3次(每次10min),然后转入MS+2mg/L KT+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+1g/L活性炭固体培养基中,暗培养7d后转至光照下培养14d,该包埋珠成活率可达60%.冻后再生苗诸多形态和生理指标与常温苗差异不具有统计学意义.     

小鼠卵泡卵母细胞的一步冷冻研究

通过对冷冻液和平衡时间的筛选,研究了裸露小鼠卵泡卵母细胞的一步冷冻。结果表明:当冷冻液含25％的1,2—丙二醇和0.25mol/L的蔗糖,平衡时间为10min时,冷冻效果最为有效,解冻后存活率和形态正常率分别达66.2％和58.1％.解冻后形态正常的卵泡卵母细胞可以发育成熟,成熟率为22.7％。     

小鼠桑椹胚OPS管内解冻和直接移植

本实验对昆明白系小鼠的桑椹胚实施OPS法玻璃化冷冻,研究不同管内解冻程序对胚胎体内外发育的影响,旨在为小家畜胚胎冷冻、解冻和移植提供技术参数。采用OPS冷冻两步法(10%(体积分数)EG 10%(体积分数)DMSO溶液中平衡30 s,移入EDFS30平衡25 s)保存小鼠桑椹胚。一步法解冻是将OPS直接插到盛有0.5mol/L蔗糖的离心管中分别平衡1、2、3、4、5和6 min,解冻后经体外培养结果表明,平衡2~4 min组囊胚发育率(93.58%~97.22%)与对照组(100%)无显著差异(P>0 05);实施两步法解冻时将OPS先后插入0.5和0.25mol/L蔗糖中,体外培养结果显示,先后平衡3和2 min组囊胚发育率(100%)最佳,同对照组无显著差异(P>0.05)。将以上方法管内解冻最佳组的胚胎用OPS管作移植导管,直接移植到受体子宫角中,其妊娠产仔率(38.57%)和管外解冻组(42.86%)及新鲜对照组(51.19%)均无显著性差异(P>0.05)。证明OPS玻璃化冷冻的小鼠桑椹胚可以进行管内解冻和直接移植,为小家畜胚胎移植提供了模型。     

小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及胚胎发育的影响

【目的】探讨小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及体外受精胚胎发育效果的影响。【方法】体外成熟液和胚胎培养液中添加小檗碱为Ber组,未添加小檗碱为对照组,MII期卵母细胞进行冷冻液处理为冷冻液处理对照组和冷冻液处理+Ber组;采用开放式拉长塑料细管法对卵母细胞玻璃化冷冻与解冻,试验各组别为GV期冷冻组、GV期冷冻+Ber组、MII期冷冻组、MII期冷冻+Ber组。观察卵母细胞体外成熟效果及其体外受精胚胎体外发育效果;观察卵母细胞冷冻化学损伤存活率及其体外受精胚胎发育率;采用尼罗红染色法观察卵母细胞中脂滴含量,观察卵母细胞玻璃化冷冻解冻后存活率及其体外受精胚胎发育率;利用差异染色法和TUNEL法计数囊胚内细胞团和细胞总数以及细胞凋亡数。【结果】Ber组能够极显著促进猪卵母细胞体外成熟,显著降低猪卵母细胞玻璃化冷冻的化学损伤,促进猪卵母细胞冷冻解冻后的细胞存活率,而猪MII期卵母细胞相对于GV期卵母细胞具有很好的冷冻解冻后的存活率;小檗碱能降低猪卵母细胞玻璃化冷冻后的脂滴含量,MⅡ期卵母细胞冷冻前后脂滴含量均低于GV期冷冻前后;小檗碱能够促进猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的体外成熟,且有利于猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后早期胚胎的发育,相对于冷冻MII期卵母细胞,冷冻GV期卵母细胞具有更好的体外发育效果;小檗碱能够提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外发育囊胚内细胞团数与细胞总数,降低其细胞凋亡,有利于提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外受精胚胎发育至囊胚的质量。而GV期相对MII期则冷冻效果更佳。【结论】小檗碱能够通过降低玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量,从而提高其冷冻解冻后体外成熟率和体外受精胚胎发育质量;GV期玻璃化冷冻卵母细胞相对于MII期,在冷冻解冻后其体外受精胚胎发育质量有更好提高。相关机制还有待今后进一步研究。     

越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存

为越橘种质资源保存提供新途径，试验研究了越橘组培苗茎尖包埋玻璃化法超低温保存方法。结果显示适宜的条件包括：剥取顶芽茎尖（长1.0～1.5 mm），在（25±2）℃黑暗条件下预培养1 d；使用移液枪吸取茎尖与藻酸盐溶液，滴入氯化钙溶液中形成包埋球（直径4 mm）；包埋球在加载液中加载1.5 h（室温）；包埋球转入PVS2溶液处理4 h(0℃)；将装有包埋球的冷冻管投入液氮保存1 h；取出液氮中的冷冻管迅速转入37℃水浴锅中解冻1～2 min，在室温下取出包埋球，在卸载液中卸载20 min；卸载的茎尖在再生培养基上（25±2）℃黑暗培养5 d；之后在正常光照条件下培养30 d。所测试的8个越橘基因型平均再生率为57.9%，最高再生率为78.5%，最低为41.7%。     

蜜蜂幼虫冷冻技术研究

以西方蜜蜂幼虫为材料,采用玻璃化冷冻方法,研究了蜜蜂幼虫冷冻技术。结果表明:从多种抗冷冻保护液中筛选出的适宜蜜蜂幼虫的冷冻保护液为15%甘油+0.2 mol.L-1蔗糖+0.2 mol.L-1木糖+3%聚乙二醇+15%乙二醇。冷冻剂类为纱布包裹型。冷冻程序:预冷时间为5 min,距液氮高度2~7 cm,降速率为1cm.min-1。解冻液为生理盐水+葡萄糖。此方法冷冻幼虫解冻后成活率为10%左右。     

玻璃化法超低温保存匍匐翦股颖胚性愈伤组织及其植株再生

采用玻璃化法对匍匐翦股颖愈伤组织进行超低温保存条件及植株再生进行初步研究.结果表明:将继代2次的愈伤组织接种到预培养基上,4℃低温预培养5 d.预培养后的愈伤组织在常温下用装载液过渡10 min,再于0℃下用玻璃化溶液PVS2处理50 min后,加入新鲜的PVS2迅速投入液氮中保存1 h以上,取出后在30℃水浴中解冻,用MS+1.0 mol.L-1蔗糖溶液洗涤3次,每次10 min,细胞存活率可达85.6%,接种在恢复培养基上培养,胚性愈伤组织能正常进行体细胞胚胎发生、成熟和植株再生.     

水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的优化

[目的]了解玻璃化冷冻一解冻及不同孤雌激活条件对水牛卵母细胞发育潜能的影响,为构建完善的水牛卵母细胞孤雌激活培养体系奠定基础.[方法]利用玻璃化冷冻法对水牛体外成熟卵母细胞进行冷冻保存1～2d,解冻复苏后进行孤雌激活,以新鲜的体外成熟卵母细胞为对照,探讨离子霉素浓度、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)浓度和处理时间对玻璃化冷冻复苏后水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响.[结果]与新鲜的体外成熟卵母细胞相比,玻璃化冷冻—解冻复苏后水牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率均极显著降低(P＜0.01).水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,以3.5 μmol/L离子霉素激活5 min联合2mmol/L 6-DMAP培养2h的孤雌激活效果最佳,其卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率分别为60.6％、45.1％、33.7％和14.8％.[结论]水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,其激活阈值发生改变,因此不宜采用与新鲜体外成熟卵母细胞一致的激活程序进行孤雌激活.     

莪术茎尖玻璃化法超低温保存技术

为莪术种质资源稳定保存提供一条新途径。以莪术组培苗茎尖为试材,用玻璃化法进行超低温保存后,于25℃用0.1%TTC溶液培养24 h后检测生活力。结果表明,切取2~3 mm长、继代培养60 d的莪术组培苗茎尖,避光条件下,用含0.3 mol/L蔗糖的MS固体培养基预培养7 d,室温下,茎尖用60%的PVS2装载液装载10 min,0℃用100%的PVS2玻璃化保护液对茎尖脱水处理30 min,快速投入液氮中进行超低温保存16 h;取出茎尖于40℃水浴中解冻2 min,室温下用US溶液洗涤20 min,立即用0.1%TTC溶液于25℃人工气候培养箱中培养24 h,莪术茎尖的生活力最高可达100%。表明该方法可用于莪术种质资源的保存。     

安哥拉山羊胚胎冷冻试验

对安哥拉山羊用总量350IUFSH按递减法处理,配种结束后第6天经子宫手术回收桑椹胚和囊胚供冷冻试验.选用1.4mol/L甘油、1.2mol/L和1.5mol/L乙二醇做防冻保护剂,快速冷冻,-36℃投入液氮保存.采用直接水浴或在空气中停留6～10s使胚胎温度回升,再水浴解冻.胚胎解冻后,用0.5mol/L蔗糖PBSS脱除保护剂,移入2%PBSS中,手术移植于发情后6d的适移受体.结果表明,1.5mol/L乙二醇具有良好的冷冻保护作用.在18～20℃空气中使胚胎温度稍回升,再水浴解冻,可降低胚胎解冻过程中热应激导致的透明带破损,移植于适移受体的妊娠率达45.5%.     

小鼠半胚冷冻的研究

对半胚冷冻的方法和条件进行了系统研究，证明采用下述程序冷冻小鼠半胚可显著提高解决半胚的成活率：①在含10%甘油的磷酸缓冲液中平衡35-40min；②在-6.5℃7或-7℃诱发结晶；③以0.05℃/min的速度缓慢降温15min；④以0.3℃/min的速度降温至-35℃投入液氮；⑤在30-35℃的水浴中解冻；⑥在含不同浓度（6.6%,3.3%,0%)甘油和0.3mol/L蔗糖的磷酸缓冲液中平衡35-40min，却除甘油。将按上述程序冷冻-解冻的16对半胚移植后，获半胚鼠12只，其中5对为同卵双生。