油棕EgNAC33基因的克隆与逆境响应表达分析

应用RT-PCR及RACE技术,克隆了油棕抗逆相关基因EgNAC33的全长cDNA;应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行了分析,同时采用qRT-PCR分析了低温、干旱及高盐胁迫处理后EgNAC33的响应表达情况。结果表明:克隆获得的基因EgNAC33的cDNA全长为1952 bp,含1个长约735 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸,该基因编码的蛋白与椰子NAC蛋白的同源性最高;EgNAC33基因受低温及高盐胁迫的诱导,其中,在8℃条件下胁迫8 h时的表达量最高,在高盐条件下胁迫24 h时的表达量最高;但在干旱胁迫下,EgNAC33的表达量基本上不受影响。     

巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗体内9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)基因,分析其基本生物学信息及在逆境胁迫下的表达分析,为进一步探讨SoNCED基因在甘蔗脱落酸(ABA)生物合成途径中的作用提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖21号为材料,待蔗苗长至5~6片叶时分别进行干旱、低温、高盐和氧化胁迫处理,利用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA未端快速扩增(RACE-PCR)克隆SoNCED基因,应用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,构建原核表达载体并进行目的蛋白的诱导表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoNCED基因在受到不同逆境胁迫时的表达情况.[结果]克隆获得的SoNCED基因(GenBank登录号JQ314108),cDNA全长为2521 bp,包含1个1827 bp的开放阅读框(ORF),编码608个氨基酸.多重序列比对及系统发育进化树分析结果表明,SoNCED基因编码的氨基酸序列与其他植物有一定的相似性,尤其与禾本科C4植物高粱和玉米的同源性最高,均达96%.成功构建SoNCED基因的原核表达载体pET-SoNCED,且通过IPTG诱导时可得到约66.0 kD的蛋白,确定该蛋白为SoNCE基因的表达蛋白.qRT-PCR结果分析表明,SoNCED基因在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下均能诱导表达,其中氧化胁迫下其表达量在6h时达峰值,其他胁迫方式下其表达量在12h时达峰值.[结论]成功克隆获得甘蔗SoNCED基因,并从不同逆境下的表达情况推测该基因在甘蔗体内参与了干旱、低温、高盐和氧化等非生物胁迫的调控过程.     

柑橘胁迫响应基因WRKY47的克隆与表达分析

以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]、芦柑(Citrus reticulata Blanco)、金柑[Fortunella japonica(Thunb.)Swingle]为试验材料,基于甜橙基因组数据库中的甜橙基因碱基序列,利用RT-PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的cDNA全长碱基序列.序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长都是1567 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸.氨基酸序列和结构分析结果显示,这4个基因编码的蛋白质属于Group IIa+IIb类WRKY蛋白.进化树分析结果显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与克莱门柚WRKY47蛋白的亲缘关系最近.对CsWRKY47启动子顺式作用元件预测分析,发现CsWRKY47启动子包含脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motiF)、抗氧化响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等多个与胁迫相关的顺式作用元件.实时荧光定量表达分析结果表明,柠檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47能被高盐、干旱、低温胁迫诱导表达;芦柑CrWRKY47在干旱和低温胁迫下诱导表达,高盐胁迫下表达量下调;金柑FjWRKY47在高盐胁迫下诱导表达,干旱和低温胁迫下下调表达.为进一步开展柑橘胁迫相关基因WRKY47的功能鉴定奠定了基础.     

火龙果HuABAR的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

在前期利用SSH筛选到抗旱相关基因HuABAR的Unigene序列的基础上,进行了HuABAR的全长cDNA克隆、生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明:HuABAR基因cDNA全长为1 239bp,5′-UTR为264bp,3′-UTR为414bp,完整开放阅读框(ORF)共561bp,编码187个氨基酸;生物信息学分析显示,HuABAR基因编码蛋白具有典型的SRPBCC结构域,并与PYR1/PYLs(pyrabactin resistance 1/PYR1like)家族具有较高的相似性;HuABAR在干旱、高温(42℃)和低温(4℃)等逆境胁迫下显著上调表达,并在干旱胁迫5d、高温3d时表达量最高,低温处理5d内,表达量持续上升;通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞质,与已报道的其他PYR1/PYLs家族基因一致。因此,HuABAR基因可能在火龙果干旱胁迫应答中发挥重要作用。     

玉米ZmCIPK基因的克隆及表达模式分析

为了克隆玉米逆境胁迫应答基因,根据玉米CIPK基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了1个ZmCIPK基因。结果表明,ZmCIPK基因cDNA全长1 776bp,5′-非编码区长249bp,3′-非编码区长177bp,编码区长1 350bp,编码449个氨基酸,预测分子量为50.64kDa,等电点为9.58。氨基酸同源性分析发现,ZmCIPK与高粱的CIPK同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmCIPK基因的表达受脱落酸、干旱、高盐胁迫和低温诱导,说明玉米ZmCIPK基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

烟草谷氧还蛋白基因NbGRX1的克隆与表达特性分析

采用同源克隆及cDNA末端快速扩增法(RACE),从烟草中克隆到1个谷氧还蛋白基因(Grx),命名为NbGRX1.该基因全长1 021 bp,编码298个氨基酸,具有典型的Grx基因结构域.Real-time RT-PCR分析表明,该基因能在烟草的根、茎、叶中表达,并且受低温、干旱和高盐诱导.     

番茄水通道蛋白基因SlAQP的克隆与序列分析

【目的】通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SlAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料。【方法】采用RACE 技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性;利用基因枪转化法将SlAQP基因与GFP融合的瞬时表达载体（SlAQP::GFP）转入洋葱表皮细胞,对该基因进行亚细胞定位;利用Real time-PCR 分析该基因在番茄品种Mirco Tom中经干旱胁迫下的表达机制。【结果】SlAQP基因（GenBank登录号：HQ433337）cDNA全长为1 107 bp,编码区含852 bp,共编码283个氨基酸。生物信息学软件分析表明,SlAQP基因含有6 个跨膜区,2 个NPA 单元,其氨基酸残基与MIP 家族蛋白保守区序列完全一致,且该基因氨基酸序列与其它物种PIP 类质膜型水通道蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。11个物种间的聚类分析表明,SlAQP基因编码的蛋白与马铃薯质膜型水通道蛋白遗传距离最近。细胞定位结果确认SlAQP基因编码蛋白在细胞质膜上发挥生物学作用。Southern杂交结果显示,SlAQP基因在番茄基因组DNA中呈单拷贝。Real time-PCR 分析结果证实,干旱胁迫下该基因表达量总体呈下降趋势。【结论】对番茄水通道蛋白SlAQP基因在干旱胁迫后的表达模式分析,预示该基因表达受逆境条件的影响,为今后进一步探讨其在干旱胁迫中发挥的作用提供了重要信息。     

玉米ZmbZIP基因的克隆及表达模式分析

根据玉米碱性亮氨酸拉链(bZIP)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术从玉米中克隆了一个ZmbZIP基因。研究结果表明:ZmbZIP基因cDNA全长1 300 bp,5′-非编码区长180 bp,3′-非编码区长226 bp,编码区长894 bp,编码297个氨基酸,预测分子量为32.4 KDa,等电点为9.39。氨基酸同源性分析发现,ZmbZIP与谷子的bZIP同源性较高。实时定量PCR检测表明,ZmbZIP基因的表达受脱落酸,干旱和高盐胁迫的诱导,不受低温诱导,说明玉米ZmbZIP基因可能参与玉米对逆境胁迫的应答。