肉牛附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一个能快速准确的检测出肉牛附红细胞体的分子生物学诊断方法,及时监控好人畜共患病。试验根据Genbank中发表的肉牛附红细胞体16SrRNA序列设计一对特异性引物,通过PCR方法,对肉牛附红细胞体基因组DNA进行扩增。结果表明:扩增出了一段412 bp的DNA片段,与Genbank中发表的肉牛附红细胞体序列同源性为98%。将建立的PCR方法对大肠杆菌、弓形体、胸膜肺炎放线杆菌的DNA进行检测为阴性,检测肉牛附红细胞体DNA的最低浓度为1.23 ng/μL。该方法快速、准确、特异性好、灵敏度高,为肉牛附红细胞体病的临床诊断提供了新的方法。     

猪附红细胞体病流行病学调查

采用直接镜检和间接荧光抗体技术(IFAT),对山西省太原、运城等市的部分规模化猪场和养猪户的6 500多头猪进行了附红细胞体病流行病学调查,结果表明,山西省猪附红细胞体病阳性率为79.6%,发病率为10%~20%。     

犬附红细胞体病诊断方法的研究

通过直接镜检、超微结构观察、血液学检查、血糖指标测定和生物学试验等方法的研究,总结出一套行之有效的能检出大附红细胞体隐性感染或显性感染患畜的综合诊断方法。其中附红细胞体碘制动试验、活力测定以及首次发现附红细胞体患畜低血糖与病原感染率和临床症状相关性等诊断方法的确立,为诊断和治疗附红细胞体病提供了理论和实践的依据。     

羊附红细胞体抗原的分析及初步应用

将提取的羊附红细胞体抗原进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析,并以此抗原为诊断抗原,用ELISA方法对64份羊的血清样本进行了初步检测。结果表明,56kDa和26kDa的羊附红细胞体抗原具有较好的免疫性,而且不与羊附红细胞体阴性血清和羊支原体病阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;ELISA检测的64份血清样本的阳性率为66.7%,比涂片镜检高22.9个百分点。     

猪附红细胞体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建一种快速、高效、灵敏的猪附红细胞体(M.suis)检测方法。本研究根据GenBank中的猪附红细胞体α-烯醇化酶(Eno)基因(序列号:AB265823.1),设计并合成了1对引物P5和P6,通过常规PCR方法对Eno基因中的一段序列进行扩增,并将其纯化后的PCR产物克隆入pMD-18T载体中,从而构建重组质粒。以阳性重组质粒为模板,建立了猪附红细胞体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。在1.44×10~6~1.44×10~2拷贝/μL范围内具有较好的线性关系,相关系数R~2=0.965,检测到的浓度下限为1.44拷贝/μL。特异性试验中仅对猪附红细胞体的检测结果呈阳性,而对猪肺炎支原体、弓形虫、猪链球菌、猪呼吸与繁殖综合征病毒的检测结果均呈阴性。重复性试验结果表明,其组内和组间变异系数均小于2.0%。用该检测方法对49份猪附红细胞体疑似血液样品进行检测,所建立的荧光定量PCR方法检测的阳性率为40.8%(20/49),高出常规PCR方法检测的阳性率1.33倍。SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的成功建立,为猪附红细胞体感染的早期诊断及定量分析提供了可靠依据。     

猪附红细胞体PCR检测方法的建立

 根据已发表的部分猪附红细胞体序列设计了一对特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出了一条约936 bp的基因片段，并成功地将该基因克隆于克隆载体PMD18-T，经酶切分析和PCR进一步鉴定后进行序列测定，结果表明，所克隆的目的基因与GenBank中发表的序列一致。并利用特异性引物初步建立了猪附红细胞体病PCR检测技术。     

猪附红细胞体特异性PCR检测方法的建立

从猪血中分离附红细胞体,提取其基因组DNA,用EcoRI对基因组DNA进行酶切,将酶切片段进行琼脂糖电泳,得到一个1.8 kb的DNA片段,根据DNA序列分析与GenBank已知基因比较和PCR方法确定该片段具有特异性,以该片段为模板进行PCR,并将其扩增产物与其它猪的其他细菌DNA扩增产物相比较,建立一种检测猪外周血中附红细胞体的特异性PCR检测方法,并通过斑点杂交试验检测该产物特异性,通过临床应用检验该法的适用性。结果表明:扩增产物大小为782 bp,其序列与已知附红细胞体序列同源性为100%,斑点杂交试验证实该产物为附红细胞体特异性产物,将该方法应用于检测10头临床症状典型的感染猪和10头健康猪的血液,所有感染和隐性带菌猪的PCR检测结果为阳性,健康猪为阴性。猪外周血中附红细胞体的特异性PCR检测方法适用于检测无临床症状的隐性带菌动物。     

羊附红细胞体小鼠模型的建立

[目的]用人工感染的方法构建羊附红细胞体小鼠模型,并对其进行鉴定。[方法]将注射地塞米松的昆明小鼠以腹腔注射方式人工感染羊附红细胞体,通过镜检、巢式PCR检测、临床症状观察、剖检及病理形态学观察对感染情况进行鉴定。[结果]羊附红细胞体小鼠模型已成功建立。[结论]可以用昆明小鼠建立羊附红细胞体实验动物模型,不仅有助于该病的诊断,而且为羊附红细胞体流行病学、致病力、免疫学以及有效药物筛选等方面的研究提供了一种合适的动物模型。     

温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立及其应用

为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法,根据温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(GenBank登录号为AY946266),设计1对种特异性引物,建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法能特异性地扩增温氏附红细胞体16S rRNA基因序列的特异性片段,检测温氏附红细胞体最低DNA量为0.178 fg。利用该方法对湖北省、江苏省和黑龙江省温氏附红细胞体病感染情况进行了流行病学调查,结果显示阳性感染率分别为10.3%、5.3%、45.8%,说明温氏附红细胞体在湖北省、江苏省和黑龙江省均存在,流行病学调查显示湖北省感染率较高、流行较广。     

猪附红细胞体特异性基因的克隆和序列分析

为分析吉林省流行的猪附红细胞体基因序列,根据发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列设计引物,扩增出长度约为541 bp的基因片段,并成功地将该基因克隆到pGEM-T Easy载体.将经Not Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,与发表的附红细胞体基因序列进行比较,试验所获得的核苷酸序列与猪附红细胞体16S rRNA基因序列非常相近,同源性为97.8%～100%,从而证明吉林省所流行的猪附红细胞体属于16S rRNA基因群.     

抗猪附红细胞体药物体外筛选试验

为筛选抗猪附红细胞体的有效药物,采用体外培养方法,对常用的治疗药物以及兰州畜牧与兽药研究所新兽药重点开放实验室研制的青蒿琥酯纳米乳进行体外筛选。通过镜检计数红细胞胞染虫率判断其作用效果,并进一步筛选部分有效药物作用质量浓度。结果表明,在体外盐酸吖啶黄效果最好,当质量浓度为500μg/mL时能起到较好的抗猪附红细胞体的作用,且在有效质量浓度范围内对红细胞的影响较轻微;其次为青蒿琥酯纳米乳,但培养过程中红细胞有崩解现象;强力霉素,贝尼尔对猪附红细胞体有一定作用;其他药物无作用。     

呼和浩特市开通养猪场猪附红细胞体病的诊治

2010年3月至2010年6月以来,对呼和浩特市开通养猪场发生的疑似猪附红细胞体病从流行特征、临床症状、病理变化、血液学检查等方面进行了综合诊断,确诊为猪附红细胞体病。该猪场母猪、仔猪、育肥猪共有1674头,发病的和疑似患病的占到28.6%,即478头。通过治疗之后,治愈率达到94.8%(454头),死亡24头,占5.02%。     

猪附红细胞体病的流行及防治对策的探讨

[目的]减小猪附红细胞体病给养殖业带来的经济损失。[方法]对该病的流行病学特点、临床症状、鉴别诊断及防治对策等方面进行了探讨。[结果]该病为传染性疾病,采用综合防治措施,可起到良好的防治效果。[结论]该文为猪附红细胞体病的防治提供了一定依据。     

动物附红细胞体病诊断方法的研究进展

简要综述了附红细胞体的实验室诊断方法,以便在临床上快速诊断,从而控制该病的发生和流行。     

猪附红细胞体病治疗试验

[目的]探讨猪附红细胞体病主要特征及治疗方法,为该病防治提供参考依据。[方法]共分为3个试验组和1个对照组,猪舍之间完全隔开,30头/组,对发病和对照组红细胞进行镜检,并进行胆红素代谢试验以及三氮脒和强力霉素治疗对比试验。[结果]发病猪红细胞周围呈刺状或无规则形状,可不规则移动,在血浆中可见到游离活附红细胞体。治疗后,血浆中游离的附红细胞体消失。发病猪血清TBIL和IBIL明显升高,治疗后,治疗组和对照组有显著差异（P〈0.05）,三氮脒组和强力霉素组之间TBIL存在显著差异（P〈0.05）,并且强力霉素组IBIL降低至正常范围内（3.51μmol/L）。[结论]附红细胞体病可引起发病猪只IBIL显著升高,临床上使用三氮脒或强力霉素均有较好的治疗效果。     

猪附红细胞体病流行病学调查

对2007～2010年信阳地区猪附红细胞体病进行流行病学调查,调查了信阳地区6 600头猪附红细胞体感染与发病情况,结果表明,该地区的猪附红细胞体阳性率89.6％,发病率为51.1％,死亡率为14.3％.     

河南省猪附红细胞体病流行病学调查

采用新鲜血液压片相衬观察和末梢血液涂片瑞氏染色镜检法,调查了河南省5个县3 000头猪附红细胞体病发病情况,结果表明,猪附红细胞体病的发病率为46.33%,死亡率为13.88%,隐性感染率为55.93%.     

猪附红细胞体病临床快速诊断与治疗方法的研究

根据流行病学调查、临床表现、剖检变化,结合血液压片相衬观察法,对猪附红细胞体病进行临床快速诊断。并对目前治疗猪附红细胞体病的10多种药物进行治疗效果观察,最终筛选出有效药物3种,临床治愈率可达90%以上。