转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

转Bt基因油菜的抗虫性分析

利用农杆菌介导的遗传转化分别将Cry1C和Cry2A的2个单价Bt基因转入油菜(Brassica napus L.),以两个纯合的转基因抗虫油菜为亲本,通过有性杂交的方法将不同Bt基因聚合,培育双价Bt抗虫油菜,并对其抗虫性和种子品质性状进行评价。结果表明,Cry1C、Cry2A在聚合后均能稳定表达,和单价Cry1C转基因植株相比,双价株系中蛋白质含量明显降低,以Cry2A为母本的聚合株系蛋白质含量降低更多,Cry1C在遗传上存在母本效应。室内接种小菜蛾二龄幼虫结果显示,转化单价和双价聚合Bt基因的抗虫性增强,其中转化单价Cry1C的抗虫性优于双价聚合Bt基因和单价Cry2A基因的转基因植株。玻璃温室栽培转基因植株,单价Bt和双价聚合Bt基因的转基因植株能生存而非转基因植株受到严重虫害而死亡。对抗性优良的单价和双价聚合的转基因植株种子品质测定发现,与未受到虫害的受体材料双低优良恢复系7-5的含油量和硫苷含量差异不显著,从而达到抗性改良的目的。     

农杆菌介导BtCry1Ac、NTHK1双价基因转化烟草植株的研究

为探讨多基因植物转化载体p096899中外源基因BtCry1Ac和NTHK1在转基因植株中的表达情况,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化野生烟草,经卡那霉素筛选,初步获得了10株转基因烟草植株.经PCR鉴定,证明目的基因已被整合到烟草基因组中.利用荧光定量PCR和ELISA分析目的基因在转录水平和翻译水平的表达量,并对转基因烟草株系进行了抗虫试验和耐盐性试验.结果表明,目的基因在转录水平和翻译水平分别得到表达,但表达量存在差异,其中2号转基因株系毒蛋白表达量最高,其含量达可溶性总蛋白的0.028 5％;饲虫试验中,部分转基因烟草株系对斜纹夜蛾的毒杀作用明显高于未转化烟草,其中2号转基因株系的抗虫性最高,饲喂第6天斜纹夜蛾幼虫死亡率达到75.56％,与Bt毒蛋白表达量相一致;在盐胁迫下,转基因烟草的叶片生长状况均好于对照(非转基因)烟草的生长.证明BtCry1Ac基因和NTHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的抗虫性和耐盐能力.     

抗虫基因cry1Ab／Ac在水稻杂交转育后代中的表达效应

以转入了Bt基因cry1Ab/Ac的水稻品系TT51为供体,与10个恢复系杂交。通过分子检测,并结合田间的抗虫性观察,筛选出农艺性状良好的转基因纯合株系。抗虫基因在所有的杂交组合后代中按照孟德尔规律遗传,但是不同遗传背景下的表达量有很大差异。 Cry1Ab/Ac蛋白含量维持原有水平的株系对螟虫表现出良好的抗性,蛋白含量降低的株系则受到轻微的危害。纯合株系的部分农艺性状发生变异,其程度与Cry1Ab/Ac蛋白含量有关。结果为利用杂交转育培育优良抗虫水稻提供依据。     

转cry3A基因马铃薯外源蛋白表达和对马铃薯甲虫抗性分析

利用生物技术工程的方法获得了转cry3A基因马铃薯株系,首先对这些转基因株系的表达量和抗虫性进行分析,结果显示,Cry3A抗虫蛋白在4个株系C3-6,C3-11,C3v-5,C3-9新鲜叶片中表达量分别为1.4,2.8,5.0,9.0μg/mg;4个转基因株系离体叶片喂养马铃薯甲虫6 d的致死率分别为30.0%,46.7%,50.0%,100%,幸存的马铃薯甲虫发育滞后1.4～4.2 d,表明抗虫性和蛋白表达量呈正相关。其次,田间调查C3-9转基因株系幼苗期叶片为害情况低于对照,C3-9百株虫口数为26.6头,对照为1 993头,该株系农艺性状和对照没有明显差异,在不使用任何农药的情况下其产量和使用农药的对照相似。因此,转基因株系C3-9为高抗马铃薯甲虫且农艺性状优良的材料。     

转Bt基因棉的检测和抗虫性鉴定研究进展

综述了转Bt基因棉的检测和抗虫性鉴定的研究概况,分别从外源Bt基因的检测、Bt毒蛋白的检测、标记基因的检测和抗虫性的鉴定4个方面进行了探讨,并提出了一些有待于研究的问题.     

美国白蛾中肠受体蛋白HcABCC4与Bt Cry9Ea10结合特性分析

为明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis Cry9Ea10毒素蛋白对美国白蛾（Hyphantria cunea）的作用,本研究测定了其对美国白蛾四龄幼虫的活性,采用邻接法构建了美国白蛾中肠受体蛋白HcABCC4系统发育树;Ligand blot和ELISA试验研究了Bt Cry9Ea10毒蛋白与HcABCC4受体蛋白间的结合能力;利用HcABCC4基因dsRNA,采用注射法比较了基因沉默前后Cry9Ea10毒素对美国白蛾的毒力变化。结果表明,Bt Cry9Ea10蛋白对美国白蛾幼虫有杀虫活性,毒力回归方程为y=-4.61+2.28x,LC50和LC70值分别为115.60和177.58μg/mL。美国白蛾HcABCC4氨基酸序列（GenBank登录号：MW727508.1）与夜蛾科棉铃虫Helicoverpaarmigera(XM049842273.1)、美洲棉铃虫H.zea(XM047179823.1)、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(XM035574947.2)、斜纹夜蛾S.litura(KP335688.1)的ABCC4氨基酸序列聚为...     

利用分子标记辅助选择培育转 Bt基因抗虫水稻

为培育转Bt基因抗虫水稻品种材料,以传统杂交的方法将3个Bt明恢63中的Bt基因cry1C*、cry2A*和cry1Ac/Ab,转育到水稻品种秀水123、湘晴、旱恢3号和沪旱1B中;以回交二代自交三代（BC2F3）水稻叶片为材料,利用分子标记辅助选择、田间除草剂筛选和试纸条检测方法,以获得新型转Bt基因株系。并在全生育期实行除不喷施农药外的正常田间管理的转基因植株的田间抗虫鉴定方法筛选出抗虫性良好、农艺性状优良的株系,为后续抗虫育种提供材料。 BC2 F3代PCR检测及试纸条检测的结果显示分别获得cry1C*和cry2A*基因的沪旱1B、秀水123和湘晴的纯合株系。同时,在田间自然诱发虫害条件下,转基因株系对稻纵卷叶螟虫表现出强抗性。     

转双抗虫基因三倍体毛白杨抗虫性分析

对经过6年田间栽植的转双抗虫基因(Bt cry1Ac和API)三倍体毛白杨部分系号再次进行分子生物学检测,初步证明外源基因在杨树基因组中稳定存在。同时以成树转基因系号叶片对杨扇舟蛾(Lymantria disparL.)和舞毒蛾(Lymantria disparL.)幼虫进行室内饲虫试验,并对幼虫致死率及树木生长情况进行了相关分析。结果表明:所检测的19个转基因系号,对两种昆虫均表现出抗虫性,分别有63.15%和31.58%的系号对舞毒蛾和杨扇舟蛾幼虫表现出高抗性(校正致死率超过80%),且不同系号对两种昆虫抗性大小是一致的,两者存在显著相关性;不同转基因系号对两种昆虫致死率与幼树相比均已明显下降;转基因明显抑制存活幼虫生长发育,且以不同系号所饲养幼虫的发育存在显著差异;转基因系号对幼虫致死率与其生长情况之间相关性不显著,表明外源基因转入时对生长没有产生影响。     

转基因抗虫棉对棉铃虫抗虫性研究

用转Bt、CPTI基因的抗虫棉材料进行抗虫性试验。研究结果表明 :1 导入不同外源基因的转基因抗虫棉因其杀虫机理不同而对棉铃虫抗性存在差异 ;2 随种植世代一代、二代、三代、五代其对棉铃虫的抗虫性下降 ;3 转基因抗虫棉的蛋白毒性在棉铃虫体内具有一定的残效 ;4 棉铃虫四龄以上幼虫对转Bt基因抗虫棉产生明显的抗性。     

Bt基因转入烟草叶绿体获得转化植株的研究

构建了苏云金杆菌晶体毒蛋白基因Cry1Ab的烟草叶绿体表达载体pCTBt,该载体以烟草叶绿体基因组trnI-trnA为同源重组片段,含有壮观霉素抗性筛选标记基因aadA、质体特异性启动子Prrn和终止子TpsbA.利用基因枪转化法,将pCTBt导入栽培烟草红花大金元叶绿体,经过4次继代筛选,获得9个抗壮观霉素的转化株系,转化频率为0.3～0.6株/枪,其中有5个株系PCR检测结果为阳性,初步确定Cry1Ab基因已整合到烟草叶绿体中.转基因烟草抗斜纹夜蛾试验表明,幼虫死亡率为10%～75%,转基因烟草植株具有较好的杀虫活性.     

转基因抗虫油菜品系选育和性状研究

为选育优质抗虫油菜新品系,在Bt毒蛋白基因成功地转化到甘蓝型双低油菜品种湘油13号后,对其植株性状、农艺性状和品质性状进行筛选,获得稳定的转Bt基因油菜品系,该品系除前期叶片稍大、叶片稍淡、苗期抗虫性较强外,其他性状与湘油13号相同。     

转Cry1Ab水稻纯合体快速准确的PCR鉴定方法

转Cry1Ab基因水稻Bt22为一种新型的转基因抗虫水稻,本研究介绍了一种筛选纯合转基因植株Bt22的PCR方法。根据外源序列在Bt22中插入位点的两侧旁邻序列设计引物,建立了转基因抗虫水稻Bt22品系特异的定性PCR检测方法,该方法灵敏度可达0.01 ng,在此基础上组合各引物建立了筛选转基因水稻Bt22纯合体的多重PCR方法,结果表明该方法简单高效,便于操作。     

抗虫Cry2Ab基因的原核表达及玉米的遗传转化

玉米的产量深受虫害的影响,抗虫Cry2Ab基因对玉米黏虫抗性有重要意义。利用外源抗虫基因Cry2Ab构建到原核表达载体pET-22b中,对其进行SDS-PAGE检测和抗黏虫性鉴定。SDS-PAGE检测结果表明,Cry2Ab基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌BL21中得到正确的表达,条带大小为70.68 kD;抗黏虫性鉴定结果表明,当Cry2Ab蛋白浓度为100μg/g时,对东方黏虫致死率达到86.66%。同时构建pCAMBIA3301-Cry2Ab-Bar植物表达载体,通过农杆菌介导法将外源抗虫基因Cry2Ab转入玉米自交系GSH9901愈伤组织中,利用除草剂筛选及PCR技术检测得到T₁转基因阳性植株4株。获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

转基因抗虫棉的培育

采用花粉管通道途径,将合成的Bt杀虫蛋白基因导入棉花优良品种泗棉3号和中棉所12,获得了转基因植株。组织化学分析表明,GUS标记基因已在R#-1代植株中表达。根据对GUS阳性转基因植株的PCR分析,证明Bt杀虫蛋白基因出现在R#-1代植株中,并通过自交传递至R#-2代。经抗虫性鉴定,获得了5株对棉铃虫有高度毒杀作用的R#-1代转基因抗虫植株S545、S591、S636、S1001（泗棉3号+Bt/GUS）和Zh1109（中棉所12+Bt/GUS）,对棉铃虫幼虫的致死率分别达到91.6%、93.8%、92.3%、85.7%和75.0%。通过自交和选育,获得了R#-5代转基因抗虫棉,并进行了抗虫性和转基因的跟踪鉴定,表明通过基因工程方法获得了抗棉铃虫的棉花新种质。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的培育

采用农杆菌介导的遗传转化法,将cry1Ab基因导入优良三系恢复系明恢63,共获得了92个独立转化株,其中13株为单拷贝。通过发芽试验,获得了11个单拷贝转基因纯合系。ELISA检测结果表明:不同株系其Bt蛋白含量不一样,但杂种的Bt蛋白含量与其亲本一致。室内人工接虫试验及田间抗虫性试验初步表明:5个纯合株系表现高度抗性,且农艺性状与原品种没有显著差异。由此说明,所获得的这些单拷贝转基因株系可作为育种材料,用于抗虫水稻的培育。     

转基因抗虫玉米Bt毒蛋白的时空表达分析

对2个转Bt基因玉米抗虫系株系进行Bt毒蛋白表达量的分析测定。结果显示,转基因株系中的毒蛋白可以在其后代稳定的遗传和表达,毒蛋白的表达为组成性表达,在玉米的各个发育时期和植株的各个部位均有表达,但其表达的量有显著差异,毒蛋白表达量随着植株的生长而减少,比较植株的各个器官,叶片毒蛋白含量最高,茎次之,根、种子和花丝中的毒蛋白含量较少。     

����MPCR����⿹�����ͳ��ݼ�ת��������Bt11

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系.结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT =0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测.     

基于MPCR法检测抗虫与耐除草剂转基因玉米Bt1

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系。结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT=0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测。     

转两类抗虫基因棉花优良纯合品系的选育

 用含合成的Cry1Ac杀虫蛋白嵌合基因 (Bt2 9K)及慈菇蛋白酶抑制剂B(API B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体 ,通过根癌农杆菌介导转化棉花生产品种冀合 32 1,获得了一批抗卡那霉素的转化再生植株。在对转化再生植株进行PCR、卡那霉素抗性和抗虫性测定的基础上 ,经 6代筛选培育出棉铃虫抗性 90 %以上且农艺性状优良的 9个转双抗虫基因棉纯合品系。各纯合株系子代植株的抗虫性及部分序列检测结果进一步表明上述Cry1Ac嵌合蛋白基因是能稳定遗传的。这些品系具有很好的农艺性状 ,其结铃性和纤维比强度明显高于转化受体冀合 32 1,这些纯合系可直接用于生产或作为双抗虫棉种质利用。