小麦胚乳中磷酸己糖的提取与测定

1 试剂与仪器 1.1 试剂 3.1mol/LHCIO_4、5 mol/LK_2CO_3、0.2 mol/LTEA-HCl缓冲液(pH7.6)、2ml mol/LNADP、3units/μl葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6p-DH)、lunit/μl磷酸葡糖异构酶(PGI)、0.4unit/μl葡糖磷酸变位酶(PGlum)、2 ml mol/L葡糖-6-磷酸(G6P)、0.5 ml mol/L果糖-6=磷酸(F6P)、O.2 ml mol/L葡糖-1-磷酸(GlP)的标准     

细胞色素P4503A46基因的异源表达及药物代谢活性分析

为了克隆巴马小型猪细胞色素P4503A46基因,建立P4503A46稳定表达肝癌细胞株(Hep G2-P4503A46),并探究其药物代谢活性,通过RT-PCR从肝组织中钓取基因P4503A46,将基因与真核表达载体pc DNA3.1连接并转染Hep G2细胞,经G418筛选10代,获得稳定表达重组细胞株Hep G2-P4503A46,以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)探针药物,将探针药物与重组细胞在优化的细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将对照组进行比较分析。结果表明,本研究成功从人Bama小型猪肝组织克隆了P4503A46基因,并通过G418筛选,成功建立了细胞稳定表达株,其硝苯地平代谢活性显著高于阴性对照组(P0.01);因此,成功克隆、并建立了小型猪P4503A46的稳定表达细胞株(Hep G2-P4503A46),该细胞株具有显著的硝苯地平代谢活性。     

人类红细胞6—磷酸葡萄糖脱氢酶分型的初步研究

人类红细胞6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)缺乏是一种先天性代谢缺陷,常可导致溶血发作。广东省有此缺陷者约占人群的5～8％,个别地区(海南黎族)可高达20％。此病已成为广东省新生儿溶血病的最常见原因。     

低温胁迫下黑龙江林蛙肝脏酶活性变化

初步分析了低温胁迫下黑龙江林蛙肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)及酯酶(EST)酶活性的变化.结果表明:1℃组的黑龙江林蛙肝脏SOD、LDH-1及EST的酶活性显著高于14℃组(P＜0.05),而2组的LDH、G6PDH及EST总酶比活力无显著性差异.为适应低温环境,黑龙江林蛙肝脏某些酶活性显著增加,维持了机体代谢的稳定.     

异丙肾上腺素对大鼠肝细胞氮代谢及6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的影响

利用原代培养的肝细胞测定了异丙肾上腺素(ISO.1×10-6mol/L)对大鼠肝细胞氮代谢和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)活性的影响.结果表明ISO可影响大鼠肝细胞中尿素氮的浓度,与对照组相比ISO实验组培养液中尿素氮水平下降了30.66%(P＜0.05),且ISO的这种作用可被β-阻断剂心得安(PRO.1×10-6mol/L)所阻断.ISO也增加3H-亮氨酸参入肝细胞的量,与对照组相比其幅度提高了19.64%(P＜0.05),同样PRO可抑制这种作用.ISO还具有增加大鼠肝细胞产生IGF-Ⅰ的趋势,但与对照组相比无明显影响(P＜0.05).ISO对大鼠肝细胞G6PDH活性具有显著影响,实验组肝细胞中G6PDH活性与对照组相比下降了42.66%(P＜0.05),ISO引起的肝细胞G6PDH活性下降的作用也可被PRO所阻断.提示ISO可通过增强大鼠肝细胞氮素的保留和蛋白质的合成,以及通过抑制肝细胞G6PDH活性影响脂肪代谢从而调节机体的生长发育.     

植物磷酸运转器的结构与功能研究进展

磷酸运转器作为调节植物光合产物运转的关键蛋白之一，一直是光合作用研究的重要内容，且多集中在对其运转的生理生化功能的研究。总结了不同类型植物的质体中磷酸运转器的基因结构及其特性，同时也比较了它们的功能。磷酸运转器由核DNA编码，分子量约为36000D。不同的磷酸运转器起源于同一祖先，后相续进化而形成。同一植物不同的基因编码不同的磷酸运转器。C3植物的磷酸运转器调节磷酸（Pi）、磷酸二羟丙酮（DHAP）和3-磷酸甘油酸（3PGA）之间的反向交换运输，而2-磷酸甘油酸（2PGA）、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、葡萄糖-6-磷酸（G6P）很少或根本不被运输。C4和CAM植物叶绿体中的磷酸运转器除了上面提到的代谢物以外还运输PEP，植物根质体中磷酸运转器也运输G6P。植物同一片叶子不同的细胞具有不同的叶绿体磷酸运转器。表1参36     

热稳定6-磷酸-β-葡萄糖苷酶TteBglB异源表达、分离纯化及酶学性质分析

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)催化6-磷酸-葡萄糖苷类化合物(如6-磷酸-纤维二糖、6-磷酸-纤维素寡糖)产生6-磷酸-葡萄糖而使纤维素完全分解,在微生物碳源利用过程中起重要作用。腾冲嗜热厌氧杆菌是一株嗜热厌氧微生物,提供了丰富的热稳定性蛋白基因资源。从该菌株中克隆编码6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因Ttebgl B,并在E.coli BL21(DE3)进行了异源表达。结果表明,TteBglB催化反应的最适p H为6.0、最适温度为70℃,在pH 4~10或70℃时有着良好的稳定性;同时证实,TteBglB属于糖基水解酶家族1(GH1)成员,可不依赖Mn2+、Ni2+、Co2+或Fe2+等二价金属离子而发挥催化作用。以pNPβG6P为底物时,催化反应的Km为0.054 mmol/L,Kcat为81.47/min,Vmax为0.003992 mmol/min,酶比活为18.093 U/mg。     

新型抗菌蛋白内溶素在大肠杆菌中的融合表达与纯化

抗菌蛋白E17G是一种通过基因改造获得的高效杀菌蛋白。为高效表达抗菌蛋白E17G并减少E17G的抗菌活性对大肠杆菌宿主菌的致死作用,将E17G基因克隆到原核表达载体pGEX 6P 1中,构建的重组原核表达载体pGEX 6P 1 E17G在低温下经IPTG诱导,E17G蛋白在大肠杆菌BL21中以GST E17G融合蛋白的形式表达,采用GST亲和层析纯化和收集GST E17G融合蛋白。SDS PAGE和Western blotting检测结果显示,GST E17G能在大肠杆菌中正确表达,为进一步研究E17G抗菌蛋白的生物学活性奠定了基础。     

基于iTRAQ技术的采后乙烯利和1-甲基环丙烯处理对茭白线粒体蛋白质表达谱的影响

利用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)标记结合二维液相色谱-串联质谱(2D-LC-MS/MS)技术,探索乙烯利(ETH)和1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对茭白采后贮藏期间线粒体蛋白质表达谱的影响。共鉴定到1 908个特征肽段≥2的可信蛋白质,与贮藏0 d相比,对照、ETH和1-MCP处理的茭白贮藏3 d和6 d共有315个蛋白质具有2. 0倍以上显著差异(P0. 05)。基因本体(GO)分子功能分析和KEGG通路分析结果显示,茭白采后贮藏3d,代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢、二羧酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,光合作用中的碳固定、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径减弱,丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解和磷酸戊糖途径相关蛋白质显著富集。ETH处理后贮藏3 d,氧化磷酸化以及甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、磷酸戊糖途径以及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成代谢途径相关蛋白质显著富集。1-MCP处理后贮藏3 d,三羧酸循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解途径相关蛋白质显著富集;贮藏6 d,磷酸戊糖途径、C5支链二元酸代谢、缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢途径相关蛋白质显著富集。以上结果表明,代谢途径、次生代谢产物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物质生物合成、碳代谢、光合作用中的碳固定、2-酮酸代谢、精氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢和二羧酸代谢途径等可能与茭白采后衰老有关,三羧酸循环、氧化磷酸化、磷酸戊糖途径、C5支链酸代谢及相关氨基酸代谢途径可能在茭白采后衰老中发挥重要作用。     

蔷薇科果树中山梨醇代谢的酶

介绍了参与山梨醇代谢的三种酶。6-磷酸山梨醇脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖和6-磷酸山梨醇之间的可逆反应,主要存在于叶片中,对山梨醇的合成起重要作用,而几乎不参与山梨醇的氧化;山梨醇脱氢酶主要存在于果实中,在NAD~+或NADP~+存在下催化山梨醇向果糖或葡萄糖的转化;山梨醇氧化酶则氧化山梨醇转化为葡萄糖。这三种酶的性质和季节性变化具有不同特点。     

桉树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的全基因组分析与进化研究

[目的]对桉树基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行全基因组分析与进化研究。[方法]利用巨桉（Eucalyptus grandsis）全基因组数据,采用BLAST等生物信息学软件分析桉树G6PDH的基因特性、蛋白序列、系统进化树以及启动子特征。[结果]桉树基因组内存在6个G6PDH基因,其编码蛋白中,1个为胞质型G6PDH,5个为质体型G6PDH,而且桉树G6PDH均含有保守基序motif1、motif2、motif3、motif7、motif9和motif11。此外,桉树G6PDH启动子序列中均存在TATA框、增强子与涉及光应答、激素应答、胁迫应答等调控元件。[结论]可为下一步研究桉树G6PDH家族基因的分子功能提供参考。     

桉树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的全基因组分析与进化研究

[目的]对桉树基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）进行全基因组分析与进化研究。[方法]利用巨桉（Eucalyptus grandsis）全基因组数据,采用BLAST等生物信息学软件分析桉树G6PDH的基因特性、蛋白序列、系统进化树以及启动子特征。[结果]桉树基因组内存在6个G6PDH基因,其编码蛋白中,1个为胞质型G6PDH,5个为质体型G6PDH,而且桉树G6PDH均含有保守基序motif 1、motif 2、motif 3、motif 7、motif 9和motif 11。此外,桉树G6PDH启动子序列中均存在TATA框、增强子与涉及光应答、激素应答、胁迫应答等调控元件。[结论]可为下一步研究桉树G6PDH家族基因的分子功能提供参考。     

HPLC-TOF/MS法检测黄曲霉毒素及霉菌指纹谱图的建立

拟建立同时检测曲霉代谢物中黄曲霉毒素和菌种鉴定的超高效液相色谱-飞行时间质谱(HPLC-TOF/MS)测定方法。寄生曲霉(菌株CGMCC3.124)经PD液体培养基培养,Qu ECh ERS方法提取净化后经飞行时间质谱质量分析器分析(正离子模式),检出CGMCC3.124代谢物中黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、O-甲基杂色曲霉素(MST)、杂色曲霉素(ST)、青霉酸(青霉酸)、曲酸(曲酸)8种代谢物。结果表明,在一定培养条件下霉菌代谢产物稳定,通过代谢软件和统计学分析,可以快速建立一种霉菌有毒代谢物筛选和分类鉴定的方法,为产毒霉菌分类系统提供一定的补充。     

耐草甘膦转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持。【方法】根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因(Actin)、外源基因(G2-EPSPS和GAT)以及侧翼序列(G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2)的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性。调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件。将转基因大豆ZH10-6和受体中黄10的基因组DNA按质量比混合,制备成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA样品,进行灵敏度检测。运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价。【结果】建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、430、338、810和1 626 bp的特异性目标条带。用该方法扩增受体中黄10时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带。多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5 U·μL-1 Ex Taq 0.2μL、10×ExTaq Buffer 2.5μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2μL、10μmol·L-1引物(GmActin11 F/R 0.4μL、G2-EPSPS F/R 0.6μL、GAT F/R 0.4μL、ZH10P1/GAT 0.6μL和G2/ZH10P20.6μL),ddH2O补足25μL。多重PCR扩增最适程序为95℃5 min;95℃30 s,60℃30 s,68℃1 min 20 s,35个循环;72℃12 min。该多重PCR体系灵敏度为0.5%,符合欧盟有关转基因产品标识的要求。该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系。【结论】建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系。     

贵州多花木兰根际溶磷菌株的鉴定及代谢组学分析

为了研究溶磷菌如何响应和应对缺磷，将难溶性磷转变成可溶性磷的机制。利用贵州多花木兰根际土壤分离筛选获得溶磷菌株PD19-4，设置无磷（CK）、难溶性磷（UP）和可溶性磷（SP）3种磷元素条件下培养，并采用LC-MS/MS 代谢组学方法分析其在不同磷元素条件下培养产生的差异代谢物。经形态学鉴定、理化特性比较和16S rDNA序列比对NCBI数据库，发现PD19-4与巴氏假单胞菌（Pseudomonas baetica）最相似，且同源性达99.65%。代谢组分析发现：（1）菌株代谢物共鉴定出253个。CU（CK∶UP）、CS(CK∶SP)和US(UP∶SP)中差异显著下调的代谢物有68、101和108个。代谢物中有机酸类、氨基酸类、碳水化合物和核苷酸类差异物最多；（2）与CK相比，UP和SP中共同上调较明显的代谢物有磷酸糖类D-甘露糖6-磷酸、D-木酮糖-5-磷酸和核酮糖-5-磷酸类物质，且仅在UP中最活跃的代谢物是D-葡萄糖-6-磷酸和2-脱氧核糖1-磷酸。与UP相比，CK和SP中有机酸类精氨基琥珀酸差异倍数较大且相反，分别为17.28 log₂FC和-17.28 log₂FC；（3）KEGG注释和富集，与SP相比，CK和UP都共同富集在精氨酸、脯氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢途径、碳代谢、磷酸戊糖途径及ABC转运体通路。仅在US中富集的代谢通路有嘌呤代谢、氧化磷酸化、氨基糖和核苷酸糖代谢。综合以上，溶磷菌株从可溶性磷转到难溶性磷环境中，主要通过增加有机酸类和氨基酸类代谢物，同时增强嘌呤代谢、氧化磷酸化、氨基糖和核苷酸糖代谢及磷酸戊糖途径来提高溶磷性。     

反相高效液相色谱法测定小鼠心肌中ATP、ADP和AMP含量及分析

建立同时测定小鼠心肌组织中ATP（三磷酸腺苷）、ADP（二磷酸腺苷）和AMP（一磷酸腺苷）含量的高效液相色谱方法。采用反相高效液相色谱模式,使用SepaxBio-C18（250ram×4．6mmID,μm,200A）色谱柱,以60mmoL·L^-1磷酸二氢钾、60mmoL·L^-1磷酸氢二钾组成的缓冲液（pH=6．68）为流动相等比洗脱,流速：O．6mL·min^-1紫外检测波长为259Nm,带宽为30nm。三种目标组分在10min内实现基线分离,平均加标回收率均在99％以上,线性范围为1-200mg·L^-1检出限分别为20、20、25ng。该法简便、准确,易于移植。     

猪体内囊尾蚴发育过程中能量代谢酶组织化学观察

采用酶组织化学技术半定量观察猪体内囊尾蚴发育过程中乳酸脱氢酶 (L DH)、琥珀酸脱氢酶 (SDH)、谷氨酸脱氢酶 (GDH)、三磷酸腺苷酶 (ATPase)、酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、6 -磷酸葡萄糖酶 (G6 Pase)、黄嘌呤氧化酶 (XOD)、脂酶 (FE)活性的变化。结果表明 ,随虫体发育 SDH,FE,ACP,AKP,ATPase活性升高 ,L DH,GDH,XOD无明显变化 ,未显示 G6 Pase活性。结果揭示随虫体生长发育糖类与脂类分解产生能量的代谢通路及物质转运途径增强 ,乳酸酵解、氨基酸分解、核苷酸分解途径无明显变化 ,虫体可能不具有糖异生作用。     

人红细胞葡萄糖—6—磷酸脱氢酶的放射免疫检测

用本实验室所纯化的葡糖—6—磷酸脱氢酶(G6PD)和所制备的兔抗G6PD血清,初步建立了人红细胞     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

黑白花奶牛初乳中G6PDH GOT与乳腺分泌机能关系的研究

本文研究黑白花奶牛初乳中葡萄糖-β-磷酸脱氢酶(G6PDH),谷草转氨酶(GOT)、三氮醋酸沉淀蛋白(TCA-P)的动态变化,以及G6PDH,GOT与乳腺分泌机能的关系。结果表明:G6PDH,GOT,TCA-P在初乳7天的分泌模式为y=Ax~(-b)。初乳中每次挤奶乳样的G6PDH总量的7天平均值与日产乳量(3个月平均)存在显著正相关(r=0.7163,n=14,P<0.01);G6PDH与TCA-P的相关系数为r=0.7183(n=35).GOT与TCA-P的相关系数为r=0.8642(n=35)。本研究认为,黑白花奶牛初乳中的G6PDH、GOT活性可反映乳腺在初乳阶段的分泌机能,并可作为预测乳产量的指标。