猪ESR基因一个外显子DNA片段的分子克隆

参考人、鸡,鼠的ＥＳＲ基因序列,设计一对引物,采用ＰＣＲ技术扩增出猪的ＥＳＲ基因一段ＤＮＡ片段,将该片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体中,重组质粒经ＰＣＲ鉴定和酶切分析确定克隆成功,经测序结果分析确定该片段为猪ＥＳＲ基因与其他动物第４号外显子相对应的一段ＤＮＡ片段,大小为３３２ｂｐ。     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

以水稻广陆矮４号为材料，利用ＰＣＲ技术从水稻基因组中扩增出１０ｋＤ富硫醇溶蛋白基因，并将其插入质粒ｐＵ１８的Ｓｍａ Ｉ位点，导入大肠杆菌ＪＭ１０９中筛选重组子。经酶切鉴定、ＰＣＲ检测获得含目的基因的克隆。采用银染测序法进行序列分析。结果表明，克隆的基因含４０２ｂｐ的ＯＰＦ，与Ｍａｓｕｍｕｒａ发表序列的同源率为８７．３％，编码１３３个氨基酸，包括２４个氨基酸的信号肽序列，推测的氨基酸序列与Ｍａｓｕｍ     

大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析

按ＣＴＡＢ法提取大肠杆菌Ｋ－１２的ＤＮＡ,应用ＰＣＲ技术获得目的基因片段（ＰＰａｓｅ基因）,低熔点胶回收后,在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下,将目的基因克隆到ｐＵＣｍ－Ｔ载体上,并转化ＪＭ１０９感受态菌中。转化获得的克隆提取质粒ＤＮＡ,０．８％琼脂糖凝胶电泳分析,并进行ＰＣＲ扩增鉴定、序列分析证明插入片段确为ＰＰａｓｅ基因。本文用ＰＣＲ技术扩增并克隆大肠杆菌焦磷酸酶基因,为导入甜菜选育高含糖量品种奠定基     

旋毛虫ES抗原结构基因TSPGⅡ重组表达质粒构建

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ,从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定,同时表达载体也用相同的酶进行酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组子,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ．     

马立克病毒糖蛋白D基因转入感染细胞DNA的研究

用ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ内切酶将已分离和克隆的马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出，克隆进反转录病毒质粒载体（ＲＣＡＳ）的连接质粒载体ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用Ｃｌａｌ再将ｇＤ重组ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ中的ｇＤ基因切出，用ＣｌａＩ将ＲＣＡＳ载体切开，将ｇＤ基因构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａＩ位点。通过原位杂交筛选重组ＲＣＡＳ，并结合酶切分析鉴定出ｇＤ插入方向正确的重组ＲＣＡＳ。用磷酸钙沉淀法将ｇＤ重组ＲＣＡＳ转染鸡胚成纤维细胞。收集转染后第９天的细胞上清，并用其感染原代ＣＥＦ，在感染后第４天和第６天收集ＣＥＦ。提取ＣＥＦ基因组ＤＮＡ，用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记ｇＤ基因片段作为探针，通过ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测基因转移情况。结果表明，转染的重组ＲＣＡＳ不仅在细胞内变成有传染性的完整病毒，而且成功地将ｇＤ基因与病毒前ＤＮＡ一起整合在ＣＥＦＤＮＡ中     

马立克氏病病毒Ⅰ型疫苗毒克隆株pp38基因同源物的扩增和克隆

用ＰＣＲ技术,从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＣＶ１９８８／Ｃ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出含起始密码子的ＭＤＶｐｐ３８基因同源物编码序列,在以Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的ｐｐ３８基因作为探针,在Ｓｏｕｌｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中,该探针能识别该ＰＣＲ扩增片段。将该ＰＣＲ扩增片段在ＢａｍＨ Ｉ和ＰｓｔＩ位点克隆进ｐＵ１８质粒载体,酶切分析筛选到含ｐｐ３８基因同源物的重组质粒并进行了全序     

番茄乙烯形成酶基因的克隆及其反义基因的表达载体构建

从成熟的番茄果实中提取总ＲＮＡ,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增合成乙烯形成酶ｃＤＮＡ,并将其克隆至载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ的ＥｃｏＲＶ位点,经限制酶谱分析,构建亚克隆进行全序列测定和序列分析。将所克隆基因以反义基因的形式定向重组到载体ｐＳＰＲＯＫ上,同时将带有完整启动子和终止子的标记基因ＢＡＲ基因引入ｐＳＰＲＯＫ中,最终获得表达乙烯形成酶反义基因和ＢＡＲ基因的植物表达载体ｐＢＡＲ－ＥＦＥ。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析‘

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒基因组ＲＮＡ,采用ＰＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＥＧＭ＾Ｒ－Ｔ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆,并进行了序列测定。序列分析表明：扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５５３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－ＲＱ－Ｋ－Ｒ－     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

以水稻广陆矮４号为材料，利用ＰＣＲ技术从水稻基因组中扩增出１０ｋＤ富硫醇溶蛋白基因，并将其插入质粒ｐＵ１８的ＳｍａⅠ位点，导入大肠杆菌ＪＭ１０９中筛选重组子。经酶切鉴定、ＰＣＲ检测获得含目的基因的克隆。采用银染测序法进行序列分析。结果表明，克隆的基因含４０２ｂｐ的ＯＰＦ，与Ｍａｓｕｍｕｒａ发表序列的同源率为８７．３％。编码１３３个氨基酸，包括２４个氨基酸的信号肽序列，推测的氨基酸序列与Ｍａｓｕｍｕｒａ的序列同源列率为８１．３％。其中含硫氨基酸占２４．１％。     

马立克氏病病毒gB基因的重组痘苗质粒构建

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ｇＢ基因序列设计ＰＣＲ引物,以ｇＢ质粒为模板,扩增出ＭＤＶｇＢ基因５’端到３’端３８８ｂｐ的ＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶消化ＰＣＲ产物,将其克隆入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒,构建中间质粒Ⅰ;用ＸｂａⅠ消化ｇＢ质粒,切出ＭＤＶｇＢ基因ＸｂａⅠ片段,并正向克隆入中间质粒Ⅰ的ＸｂａⅠ位点,将ＭＤＶｇＢ基因１３７ｂｐ的ＰＣＲ产物与其ＸｂａⅠ片段正向连接,构建中间质粒Ⅱ用ＥｃｏＲⅠ调出中间质粒Ⅱ中的ＭＤＶｇＢ基因,正向克隆入痘苗病毒表达载体ｐ１６启动子下游,构建ＭＤＶｇＢ基因表达质粒ｐ１６－ＭＤＶｇＢＭＤＶｇＢ基因重组痘苗表达质粒的成功构建,为下一步进行重组病毒的构建及ＣＴＬ应答的深入研究奠定了基础     

马立克病毒糖蛋白D基因转入感染细胞DNA的研究

用ＥｃｏＲⅠ，ＰｓｔⅠ内切酶将已分离和克隆的马立克氏病病毒糖蛋白Ｄ基因从重组ｐＭｇＤ１８质粒中切出，克隆进反转录病毒质粒载体的连接质粒载体ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ的相同位点。用ＣｌａⅠ再将ｇＤ重组ｐＵＣＣｌａ１１２Ｎ中的ｇＤ基因切出，用ＣｌａⅠＲＣＡＳ载体切开，将ｇＤ基因构建于ＲＣＡＳ的ＣｌａⅠ位点。     

新城疫病毒Ulster株血凝素-神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株经ＳＰＦ鸡胚增殖和超速离心纯化后，以酚－ＳＤＳ法提取其基因组ＲＮＡ，作为反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的模板。根据其已发表的Ｆ和ＨＮ基因核苷酸序列，合成一个长为３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于Ｆ基因内）和一对分别长为２８、３０ｍｅｒ的寡核苷酸（位于ＨＮ基因两侧）分别作为反转录引物和ＰＣＲ引物。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，出现一条长为１．９３ｋｂ的特异性条带，与预期相符。并将此特异性条带克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，并经限制性核酸内切酶分析（ＲＥＡ）。ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＥＡ结果证实其为新城疫病毒Ｕｌｓｔｅｒ株的血凝素－神经氨酸酶基因。     

鸡传染性支气管炎腺胃病变型分离株H_(95)免疫原基因的克隆与鉴定

用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从纯化的腺胃病变型鸡传染性支气管炎分离株病毒基因组ＲＮＡ扩增出约１．７ｋｂ的ＩＢＶＳ１基因。将该扩增产物于ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中，对重组质粒载体进行酶切分析，得到与Ｓ１基因预期大小一致的插入片断。经Ｓ１探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测，表明插入片断为Ｓ１基因。利用该法筛选到４株阳性重组质粒转化子。     

旋毛虫肌幼虫ES抗原基因TSPGⅡ在真核细胞中的表达

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中工出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因,经ＥｃｏＲⅠ和ＢｓｔＸⅠ酶切鉴定;表达载体用相同的酶切,经琼脂糖凝胶电泳,分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ＰＳＶ．ＳＰＯＲＴⅠ表达载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向接连,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取重组,经ＥｃｏＲⅠ,ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定,构建了重组表达质粒ＰＳＶ．ＴＳⅡ。利用脂质体作载体,将重且表达质粒转     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的 …

以大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的ＲＮＡ为模板,采用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,扩增出１１３４ｂｐ的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒ｐＵＣ１９Ｄ。以Ｋｐｎｌ从Ｘｂａｌ从ｐＵＣ１９Ｄ上切下此基因并插入质粒ｐＥｍｕ－ｍｃｓ－Ｎ得到植物表达载体ｐＰＰＩ８。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴１２７、陕１６０和晋麦４７,通过卡那酶     

β—1,3—葡聚糖酶基因植物表达载体的构建

采用ＰＣＲ的方法,对严自大麦ｃＤＮＡ克隆的β－１,３－葡聚糖酶基因进行了扩增,在此基因的５’及３’端分别加入了克隆所需的ＸｂａＩ和ＳｓｔＩ限性酶切位点,定向克隆到经改造的质粒载体ｐＢｉｎｈ中,获得了含有β－１,３－葡聚糖酶基因的植物表达载体ｐＢｉｎｈ－Ｇｌｕ。     

番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定

利用ＰＣＲ技术,从纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３基因。将该ＰＣＲ扩增片段克隆入ｐＵＣ１８质粒载体的ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅠ位点之间,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３。结果表明：该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ２基因的克隆。     

IBVS1基因RT－PCR产物的分子克隆

报道了在两条引物的５′端加有不同酶切位点的ＩＢＶＤ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物与ｐＵＣ１８进行分子克隆的研究情况。采用自己改进的微量基因克隆的方法，经回收的插入片段的分子量大小及ＨａｅⅢ酶切分析，证明获得了两株重组质粒转化子