枣叶绿体基因组DNA提取方法研究

提取高质量的叶绿体基因组DNA是叶绿体基因组测序分析的重要环节。研究以冬枣、晋枣成熟叶片为材料,采用高盐-低pH法和改良的高盐-低pH法比较研究枣叶绿体分离和叶绿体DNA(cpDNA)提取。结果表明,高盐-低pH法提取的cpDNA,其OD260nm/OD280nm值均为1.28,质量低,不能满足后续测序要求;改良高盐-低pH法提取的cpDNA产量明显得到提高,且cpDNA结构完整、质量高、纯度好,OD260nm/OD280nm值介于1.8~2.0,无降解现象,RNA消化完全,能满足后续测序要求。     

紫花苜蓿线粒体和叶绿体DNA高效提取体系的建立

细胞质雄性不育系是作物杂种优势利用的有效途径,分离其不育系线粒体和叶绿体基因组是深入探究细胞质雄性不育分子机制的重要环节,本研究以紫花苜蓿细胞质雄性不育系CMS1和野生对照植株WT为研究材料,选取新鲜叶片经冷冻匀浆、差速离心分离叶绿体和线粒体、DNase I降解核DNA、蛋白酶K裂解线粒体和叶绿体、酚—氯仿—异戊醇去除蛋白质和用乙醇沉淀叶绿体DNA(cpDNA)和线粒体DNA(mtDNA),结果如下:(1)叶绿体提取液中叶绿体数量的平均值为1 500个/m L,而詹纳斯绿B染色观察发现提取液中线粒体结构完整、含量较多;(2)叶片取材量为4 g时,CMS1(WT)的cpDNA平均产率为0.41(0.47)μg/g,而mtDNA的平均产率为1.15(0.83)μg/g;改进叶片取材量为10 g时,两种苜蓿材料的cpDNA和mtDNA的平均产率升高至2.17μg/g和2.22μg/g,并且纯度好(cpDNA和mtDNA的OD260/OD280均保持在2.0左右);延长蛋白酶K消化处理时间(2 h,4 h和6 h)可以提高紫花苜蓿cpDNA和mtDNA的产率,其中消化4 h的mtDNA质量浓度最高(59.9 ng/μL),而cpDNA浓度则在孵育6 h后达到最高值24.3 ng/μL;(3)紫花苜蓿CMS1和WT的mtDNA和cpDNA琼脂糖凝胶电泳检测发现,细胞质基因组条带清晰,无拖尾现象,进一步表明采用以上方法提取的紫花苜蓿mtDNA和cpDNA符合分子遗传学研究的标准和要求。     

红麻叶绿体DNA非编码区扩增及PCR-RFLP多态性分析

为研究红麻叶片叶绿体DNA(cpDNA)非编码区的序列特征,采用改良CTAB方法提取红麻总DNA,以8份红麻光钝感突变体及其4份近缘种基因组DNA为模板,应用8对植物cpDNA通用引物对红麻cpDNA非编码区序列进行PCR扩增,优化cpDNA非编码序列PCR的扩增条件,应用4种限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ、TaqⅠ、AulⅠ)酶切扩增片段.结果表明:所筛选的通用引物适用于红麻cpDNA非编码序列扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测,片段大小为400-2000 bp,共扩增cpDNA片段大小约13000 bp.将PCR扩增产物进行酶切,每个片段均有相同的酶切位点,只有cp4引物对cpDNA的扩增产物经AluⅠ酶切获得多态性片段,红麻光钝感突变体及其对照的cpDNA存在部分变异,该结果可为进一步探讨红麻叶绿体基因组种内的变异情况提供理论依据.     

紫丁香与羽叶丁香叶绿体DNA提取方法研究

为了探究适合丁香属植物的叶绿体DNA(cpDNA)的提取方法,采取高盐-低pH法和改良高盐-低pH法分别分离提取了紫丁香与羽叶丁香的叶绿体及cpDNA。结果表明,采取高盐-低pH法提取出的cpDNA,其OD260/OD280值均1.7,且琼脂糖凝胶电泳检测无条带,表明cpDNA质量低,不能满足后续叶绿体基因组测序要求,改良高盐-低pH法提取出的cpDNA,其OD260/OD280值在1.8~1.9,琼脂糖凝胶电泳检测显示条带清晰,无降解现象,表明cpDNA质量高,能够满足后续叶绿体基因组测序要求。研究表明,改良高盐-低pH法可简便快速的提取紫丁香与羽叶丁香的cpDNA,为进一步研究丁香属植物的叶绿体基因组奠定了基础。     

玉米CMS-C同质异核、同核异质系叶绿体基因组比较分析

【目的】基于玉米细胞质雄性不育材料粗制线粒体DNA高通量测序数据,对叶绿体基因组进行组装。【方法】应用Illumina Hiseq 2500平台进行线粒体DNA测序。利用软件Velvet对过滤后的clean reads进行拼接和叶绿体基因组的组装。采用在线注释软件DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/)对叶绿体基因组完整序列进行基因预测和基因功能分析。【结果】成功组装出C48-2和C黄早四2个不育系及48-2和黄早四2个保持系的叶绿体基因组,大小分别为140 473 bp(C48-2)、140 478 bp(C黄早四)、140 458 bp(48-2)、140 448 bp(黄早四),均包含84种编码基因,30种tRNA基因,4种r RNA基因。新组装的4个叶绿体基因组,在基因组大小及所包含的基因种类及数量方面都与叶绿体参考基因组具有较高的相似性,说明粗制线粒体的高通量测序数据可以用来组装叶绿体基因组。叶绿体基因组高度保守,但也存在SNP及InDel,基于不育系与保持系叶绿体DNA(cpDNA)的SNP位点设计特异引物,可用来鉴定区分CMS-C不育胞质与正常胞质。【结论】利用粗制线粒体DNA的高通量测序数据可以完成叶绿体基因组的组装,玉米CMS-C不育系与保持系的叶绿体基因组具有高度的一致性,但也存在一些多态性位点,基于多态性位点成功开发出可区分CMS-C不育胞质与正常胞质的特异标记。     

菊芋叶绿体分离方法比较研究

以菊芋叶片为材料,通过比较提取其叶绿体DNA的5种方法(改良高盐-低pH法、Percoll密度梯度离心法、GENMED试剂盒物理法、GENMED试剂盒化学法及DNaseⅠ差速离心分离法),筛选出适合菊芋叶绿体NDA的提取方法。利用显微镜、核酸蛋白测定仪、琼脂糖凝胶电泳及菊芋基因特异引物RAPD检测。结果显示:改良高盐-低pH法分离得到的叶绿体在40×物镜下其数目多,浓度高,背景清晰,提取菊芋叶片cpDNA的OD_(260)/OD_(280)为1.926,质量浓度为295.63μg/μL。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测发现,cpDNA条带清晰整齐,无核DNA污染;且提取的cpDNA通过4对引物均能扩增到片段。结果表明,改良高盐-低pH法能够快速获得菊芋高质量的叶绿体DNA。     

甘蔗叶绿体DNA的提取方法及其验证分析

[目的]探索适于普通实验室条件的甘蔗叶绿体DNA（cpDNA）提取方法,为甘蔗叶绿体分子生物学研究提供参考.[方法]参考水稻、小麦等作物cpDNA的DNase Ⅰ差速离心处理法,采用改良的DNase Ⅰ差速离心法提纯甘蔗cpDNA,并对其trnL基因序列进行比对分析,证实所提取cpDNA的可行性.[结果]采用改良的DNase Ⅰ差速离心处理法提取能得到量多、杂质少的cpDNA,用Eppendorf蛋白核酸测定仪检测,平均每克甘蔗样可提取2.71 μg cpDNA,OD260/OD280为1.79～1.90.对提取的cpDNA的trnL基因序列进行比对分析,证实参试的甘蔗栽培种、斑割复合体后代及其回交材料的叶绿体trnL基因与已报道的甘蔗栽培种NCo 310、SP-80-3280和割手密HN0046的trnL基因相似度均在99.0％以上,并在381、386、389、392、393、400、488、490 bp等8个位点上检测出碱基突变、插入和缺失现象.[结论]采用改良的DNase Ⅰ差速离心处理法提取甘蔗叶绿体DNA具有可行性,提取的甘蔗cpDNA完全可以用于后续的分子水平研究.     

基于叶绿体DNA变异的山荆子种质遗传多样性和系统演化

【目的】山荆子是中国原产苹果属植物中分布最广泛的种,母系遗传的叶绿体基因组的非编码区适用于较低的分类阶元(如科、属)的系统研究。对野外考察新收集的山荆子种质的叶绿体DNA(cpDNA)非编码区进行测序,解析其序列遗传变异,从母系遗传基因的角度探究山荆子不同居群的遗传多样性和系统演化关系,为我国山荆子种质资源的起源演化以及收集和保护提供理论依据。【方法】利用4对叶绿体DNA引物扩增新收集的215份山荆子种质资源的4个非编码区trnH-psb A、trnS-trnG spacer+intron、trnT-5'trnL和5'trnL-trnF,对每个基因间区正反向测序获得的序列进行人工校对后,使用MEGA 7.0进行序列拼接和比对,并构建山荆子不同居群间基于遗传距离的Neighbour-Joining系统发育树;使用DnaSP ver5.10.01计算叶绿体DNA的遗传多样性参数,计算不同居群间的基因流和基因分化;利用Arlequin v3.5分析标准分子变异(AMOVA);运用NetWork ver4.6.1.2构建种内居群间的叶绿体DNA单倍型邻接网络关联图。【结果】4个叶绿体DNA非编码区经测序、拼接、比对和合并之后的片段长度为3 777 bp,共有171个多态性变异位点,其中包含150个插入-缺失位点、20个简约信息位点和1个单一突变位点。在215份山荆子种质中,trnH-psb A、trnS-trnG spacer+intron、trnT-5'trnL和5'trnL-trnF区域的变异位点数量分别为26、32、103和10个,单倍型数量分别为8、8、6和4个,合并之后的叶绿体DNA片段的单倍型为24个。核苷酸多样性最高的区域为trnT-5'trnL(Pi=0.01174),单倍型(基因)多样性最高的为trnS-trnG spacer+intron(Hd=0.599),最低的为5'trnL-trnF(Hd=0.228)。215份山荆子种质叶绿体DNA多样性较高(Hd=0.727,Pi=0.00577)。Tajima's D检验中,4个cpDNA区域在各检验水平上均不显著,检测的4个cpDNA区域在进化上遵循中性模型。AMOVA分析表明遗传变异主要存在于群体内部。【结论】供试4个叶绿体DNA非编码区适合苹果属山荆子种质遗传多样性和系统演化分析。在叶绿体DNA水平导致山荆子群体进化的原因不是自然选择,而是突变压力和遗传漂变。群体间遗传分化与其地理距离不完全相关。山荆子可能为多点起源,推测黑龙江和吉林,内蒙古,甘肃和山西为3个可能的起源地区。     

太湖地区水稻地方品种籼粳分类方法的比较

取太湖地区水稻地方品种99份(籼稻49份,粳稻50份)。比较分析了由品种的酚反应、氯酸钾抗性和稃毛长综合计算的判别值Z1;由硅酸体形态计算的Z2;根据叶绿体DNA电泳谱带判别栽培稻亚种类型的效果。结果表明:用叶绿体DNA判别栽培稻亚种类型的准确率最高,达95%;根据特性分类系数(Z1)划分籼粳类型的准确率次之,达86%;根据硅酸体形态分类系数(Z2)的判别准确率最低,为73%。     

苜蓿叶绿体DNA的提取及其Rbcl基因片段的克隆

[目的]获得高纯度的苜蓿叶绿体DNA（cpDNA）和Rbcl基因片段。[方法]采用改进的高盐低pH法分离和纯化苜蓿叶绿体DNA;利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,设计引物,从苜蓿叶绿体基因组中扩增Rbcl基因,利用生物学软件对测序结果进行分析。[结果]经检测分析,获得了产率较高和纯度较好的苜蓿叶绿体DNA,并用PCR方法扩增获得了1 130 bp的Rbcl基因片段。该基因片段有17个常用的限制性内切酶酶切位点,与烟草、水稻、菜豆、玉米、甘薯和甜菜中Rbcl基因核苷酸的同源性为85.6%～90.6%。[结论]为构建苜蓿叶绿体表达载体和通过叶绿体生物反应器生产药用蛋白等奠定了基础。     

‘美人’梅的父系推测分析

以宫粉型梅花、‘紫叶李’与‘美人’梅共计 71个样品的AFLP指纹数据为基础 ,采用NTSYSpc2 1t软件计算Nei’s(1 972 )遗传距离和Dice相似性系数 ,分别进行聚类、排序分析。依据所显示的亲缘关系以及花粉可育性 ,初步推测确定‘美人’梅可能的父系为‘清明晚粉’、‘大宫粉’、‘粉玉宫粉’和‘蔡山宫粉’。     

台州梅花品种资源收集及繁育技术研究

在对台州梅花品种资源的调查基础上,建立台州梅花品种资源圃,搜集和引进各类梅花品种14个类型、65个品种,提出了梅花在当地的扦插、嫁接等繁殖方法,筛选出以梅花秋梢为外植体、腋芽单芽培养诱导愈伤组织等技术方法。     

云南丽江梅花新品种选育研究

通过对云南丽江地区梅花种质资源性状的观察及评价,采用实生选育以及杂交育种两种方式开展了花果兼用梅新品种的选育研究。结果表明:根据制定的花果兼用梅新品种的选择标准,在云南丽江果梅优株中通过实生选育方式选育出了5个花果兼用梅新品种,即‘七河4号’、‘七河14号’、‘七河21号’、‘拉市优4号’、‘江边7号’;通过杂交育种的方式得到了优株‘七河11号’与‘乌羽玉’的杂交后代。     

梅花花粉生活力的测定和比较

采用悬滴法在15%蔗糖 0.1%硼酸的培养液上对97个梅花品种花粉的萌发率进行了测定和比较,结果表明,不同梅花品种及同一品种不同年份的花粉生活力均存在差异:97个品种中,粉瓣果梅、大宫粉等17个品种的花粉萌发率高达50%以上,寒红、银红台阁、粉红朱砂、桃红朱砂、磨山垂碧5个品种的花粉完全败育。另外,花粉数量和花粉生活力存在一定的相关性,花药散粉量越大,花粉生活力越高。     

梅与其近缘种亲缘关系的AFLP分析

以包括野梅在内的15个梅品种、1个野生种和其近缘种杏、山杏、桃、山桃、李和‘垂枝’毛樱桃、‘紫叶’李为试材,运用AFLP标记,采用7对引物组合(E-ACTM-CAT、E-GAM-CTC、E-ACTM-CCA、E-ACTM-CAC、E-ACTCTC、E-ACTCAG、E-ACCM-CAG)选择性扩增得到287个多态性条带的6888条带数据,使用NTSYSpc2.1t软件,采用Nei’s(72)遗传距离,SAHNClustering进行不加权成对算术平均法聚类分析,得到了梅品种与近缘种的亲缘关系与形态学、育种记录等相关记录相符的结论,并支持梅花二元分类系统的相关分类。     

青岛梅花新品种选育研究

通过对梅花种质资源以及梅花育种研究的总结,对梅花品种资源进行实地调查,得到270个梅花品种的详细性状信息;结合对花梅和果梅的性状研究分级,选出7个性状作为花果兼用梅新品种的选择标准。根据花果兼用梅新品种的选择标准,在山东青岛通过实生选育以及杂交育种等方式培育,并且通过芽变选种选出4个抗寒花果兼用梅新品种。     

梅树品种分类研究进展

该文回顾了梅树品种分类方面的研究,重点介绍了３０年来的成果,将品种分类历程划分为４个阶段,即传统园艺分类阶段、品种收集整理阶段、形态系统分类阶段和综合系统分类阶段．概述了梅的起源、品种演化等方面的重要进展．     

梅花种质资源表型多样性研究

[目的]研究梅花（Prunus mume Sieb.et Zucc.）种质资源的表型多样性,为梅花遗传多样性研究提供试验数据,为其优异种质的保存、开发和应用奠定基础。[方法]对149个梅花品种的表型多样性进行研究。[结果]在9个质量性状中,花部、果实和枝型的Shan-non指数均值分别为1.195、1.023和0.341,Simpson指数均值分别为0.576、0.539和0.192。在6个数量性状中,花部、枝条、叶片平均的变异系数分别为20.45%、19.98%、14.07%。花径和花瓣数,花径和雄蕊数,花瓣数和雄蕊数达到了极显著的相关。[结论]梅花花部性状变异最丰富。     

利用RAPD分析梅栽培品种间的遗传变异

利用RAPD标记分析了梅16个栽培品种间的遗传变异。32个10碱基的随机引物扩增出181条谱带,其中138条为多态性谱带。相似系数的计算结果表明:梅栽培品种间存在较大的遗传多态性,但主要表现在真梅系与杏梅系、樱李梅系之间;聚类分析结果显示,RAPD能区分开梅的3个系,并且支持形态学分类中将枝姿作为一级分类标准的论断。     

梅染色体研究

为了研究梅染色体,鉴定梅品种资源的倍数性,为梅分类起源和遗传育种提供细胞学依据,该文采用“去壁低渗法”对我国９个省区梅５个变种,２个变型,１０８个栽培品种的染色体数目进行了观察．首次发现原产我国的云南杏梅是二倍体２ｎ＝２ｘ＝１６,但有９．５％的四倍体２ｎ＝４ｘ＝３２细胞．江苏南京的‘迟红’梅品种是二倍体和四倍体的嵌合体,２ｎ＝２ｘ＝１６,２ｎ＝４ｘ＝３２．其余供试材料均为二倍体２ｎ＝２ｘ＝１６．