改进亚硫酸盐测序技术研究拟南芥DNA甲基化水平

DNA胞嘧啶甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式,在细胞增殖、分化、发育、基因组印迹、基因表达调控等过程中起着重要作用.随着对DNA甲基化研究的深入,各种DNA甲基化检测方法被开发出来满足不同类型的研究需求.通过实验建立的一种改进亚硫酸盐测序技术,将拟南芥基因组DNA经酶切纯化后,用亚硫酸盐修饰液修饰,将PCR产物克隆到pEASY-T1载体上,每个样品随机挑取15个阳性克隆,测序分析,研究拟南芥错配修复基因MutL-homologue 1 (MLH1)启动子区域的甲基化水平.结果表明:与传统亚硫酸盐测序法相比,改进方法有利于DNA完全修饰,既减少了修饰时间,又提高了PCR目的片段的特异性、稳定性和重复性;MLH1基因启动子区域甲基化比率为27.3％,而不是45.6％,避免了非甲基化位点的错认.为植物DNA甲基化分析提供了一种更为理想的研究手段.     

DNA去甲基化酶对拟南芥Laccase家族基因甲基化及转录模式的影响

植物Laccase家族蛋白,是铜蓝氧化酶超家族的重要成员,具有包括抗病性在内的多种生物学功能。利用拟南芥野生型及ros1、rdd和dme突变体的全基因组甲基化测序(BS-SEQ)数据,分析了拟南芥Laccase蛋白家族基因(AtLACs)的DNA甲基化模式。结果表明:在野生型和不同DNA去甲基化酶突变体中,该家族少数成员在基因上游区和转录区存在较高水平的甲基化修饰现象。转录组测序(RNA-SEQ)数据分析结果显示,在野生型和不同突变体中,AtLAC家族基因的转录水平普遍较低。而AT5G48100基因在拟南芥胚乳细胞中剧烈表达,DME突变后,其表达水平进一步剧烈增强。综合而言,在野生型和不同DNA去甲基化酶突变体中,AtLAC基因家族大部分成员的DNA甲基化修饰与转录调控关联不强,但有些基因的DNA甲基化程度与转录水平之间有密切联系。     

热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响

【目的】探讨热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥抗坏血酸过氧化物酶的影响。【方法】以T-DNA插入AtHsfA1a基因突变拟南芥及野生型植株为材料,采用分光光度法比较热胁迫下不同基因型植株的抗坏血酸过氧化物酶(APX,EC1.11.1.7)活性的变化,RT-PCR法研究AtHsfA1a对APX表达的影响,染色质免疫沉淀技术和凝胶阻滞电泳分析体内外研究AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合情况。【结果】在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中的APX的活性低于野生型,且AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中的APX的mRNA的相对量低于野生型;体内研究发现在热胁迫下AtHsfA1a基因突变拟南芥植株中未筛选出APX基因启动子区片段,而野生型筛选出APX基因启动子区片段,体外研究发现AtHsfA1a与APX基因启动子区的结合是直接的。【结论】热激因子AtHsfA1a突变对热胁迫中拟南芥APX的影响是从转录调控水平直接影响APX的表达。     

缺氮胁迫对固氮蓝藻鱼腥藻PCC7120 DNA甲基化修饰模式的影响

为研究缺氮胁迫对固氮蓝藻DNA甲基化的影响,本研究以固氮蓝藻鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120为试验材料,比较了正常藻丝、缺氮藻丝和异形胞的DNA甲基化修饰。DNA甲基化修饰与细胞分化、基因组印记等多种重要生物学过程有关。在高等植物和非固氮蓝藻中,缺氮胁迫可以改变DNA甲基化修饰模式。DNA甲基化修饰也存在于固氮蓝藻细胞中。然而,固氮蓝藻可以通过固定空气中的氮来缓解缺氮压力,缺氮胁迫是否能改变固氮蓝藻的DNA甲基化修饰模式尚不清楚。全基因组重亚硫酸盐测序可以在单碱基水平分析基因组范围内所有胞嘧啶的甲基化修饰模式。利用全基因组重亚硫酸盐测序对正常培养的藻丝、缺氮72h的藻丝和异形胞的胞嘧啶甲基化进行了测序,分别获得6.25,8.38,7.11Gb的干净数据。在正常培养的藻丝、缺氮72h的藻丝和异形胞中,甲基化胞嘧啶位点占所有胞嘧啶位点的比例分别为1.06%,1.05%和1.05%,甲基化胞嘧啶位点的平均甲基化水平分别为0.61%, 0.54%和0.54%。基于胞嘧啶甲基化修饰模式对这3个样品进行Pearson相关性分析,发现样品间的相关系数在0.976～0.983之间。这些结果说明正常培养的藻丝、缺氮72h的藻丝和异形胞的DNA甲基化修饰模式相似,缺氮胁迫不能引起固氮蓝藻DNA甲基化模式的改变。本结果为固氮蓝藻和非固氮蓝藻采用不同的表观修饰来应对缺氮胁迫提供了证据。     

鸭骨骼肌TNNI1基因CpG岛区甲基化与mRNA差异表达

本研究旨在通过克隆鸭慢速骨骼肌型肌钙蛋白I 1(Slow skeletal muscle troponin I 1,TNNI1)基因5'侧翼区序列,检测鸭骨骼肌组织TNNI1基因的mRNA表达水平和启动子CpG岛区甲基化状态,初步探索TNNI1基因转录调控机制。采用染色体步移方法克隆测序获得鸭TNNI1基因5'侧翼区序列,进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)检测鸭胸肌和腿肌TNNI1基因mRNA表达水平,采用亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)检测核心启动子区CpG岛在鸭肌肉组织中的甲基化水平。结果表明,克隆获得鸭TNNI1基因5'侧翼区序列2 078 bp,预测存在2个CpG岛,其中CpG岛(-2 032～-1 833 bp)位于预测的核心启动子区内,并存在多个真核生物结构元件和转录因子结合位点;甲基化检测发现,其总体甲基化水平在胸肌和腿肌组织中分别为52. 66%、57. 04%,差异不显著(P0. 05);荧光定量检测结果表明,鸭胸肌和腿肌TNNI1基因表达量差异显著(P0. 05);相关性分析结果表明,CpG4位点甲基化程度与胸肌TNNI1基因表达量呈极显著负相关(P0. 01)。鸭胸肌和腿肌TNNI1基因的mRNA表达量存在显著差异,其总体甲基化水平无显著差异。在胸肌中,启动子区CpG4位点可能通过甲基化修饰影响TNNI1基因的转录调控。     

非生物胁迫诱导拟南芥中防御基因表达的分子机制

以缺水处理、低温胁迫和盐胁迫的拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物作为试验材料,采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR),检测水杨酸(SA)途径调控基因AtACD6和下游防御基因AtPR5的表达水平。分析结果证实了非生物胁迫处理的植物中这些防御基因的表达水平明显增加。亚硫酸盐测序结果证明非生物胁迫诱导AtACD6基因启动子区域的DNA去甲基化,导致该基因的转录激活。进一步研究证实,沉默抑制因子1(ROS1)介导的DNA去甲基化,在低温诱导AtACD6基因表达的过程中起重要作用。揭示了植物水杨酸途径防御基因应答非生物胁迫相关的分子机制中ROS1起重要作用,为探索植物适应不利环境的表观调控机制提供参考。     

鸭MyoG基因启动子的生物信息学分析及其甲基化频率对基因表达的影响

采用RT–PCR技术扩增和克隆鸭Myo G基因启动子,并对其启动子序列进行生物信息学分析,采用Sequenom Mass Array技术检测Cp G岛在鸭肌肉组织中的甲基化水平,用q RT–PCR检测Myo G基因的表达量。结果表明,扩增得到鸭Myo G基因启动子序列2 730 bp,对启动子序列预测后,发现存在2个Cp G岛,其中Cp G岛(–2 536~–1 997 bp)存在5个转录因子结合位点和多个真核生物结构元件。甲基化检测结果表明:在鸭的个体和组织水平上,启动子甲基化率均未聚类在一起;Cp G位点甲基化频率存在个体差异,22%Cp G位点的甲基化频率与Myo G的m RNA表达量呈负相关(P0.05),78%Cp G位点的甲基化频率呈正相关(P0.05),其中,腿肌甲基化位点Cp G_1、Cp G_26.27.28.29的甲基化频率与Myo G基因表达水平均呈显著相关(P0.05)。Myo G基因在鸭与在哺乳动物中的转录调控机制存在差异。试验中发现多个影响鸭Myo G基因转录的潜在甲基化位点,其中Cp G_1与Cp G_26.27.28.29能通过DNA甲基化修饰影响Myo G基因在鸭腿肌中的转录。本研究结果可为鸭Myo G基因转录调控提供参考依据。     

DNA甲基化对植物生长发育的调控研究

DNA甲基化修饰在表观遗传中占据重要的位置,DNA甲基化会改变启动子调节区域的功能状态,但不会改变胞嘧啶碱基序列。在植物中DNA甲基化发生在C的任何序列上:CG,CHG及CHH(H=A,T或者C)。植物中的DNA甲基转移酶主要分为3类,染色质甲基化酶(CMT)、甲基转移酶I(MET I)和结构域重排甲基转移酶(DRM)。DNA甲基化主要通过调控基因的表达,如植物转座子的沉默,内源基因表达,春化作用,植物防御作用等,进而调节植物的生长发育。     

奶牛COL1A2基因启动子区甲基化与其基因表达及乳腺炎的相关性分析

本研究分析奶牛健康乳腺组织和金黄色葡萄球菌感染的乳房炎乳腺组织中胶原蛋白Ⅰ型α2链基因(COL1A2)启动子区CpG岛甲基化与COL1A2基因表达的调控关系,为奶牛乳房炎的抗性育种及预防提供理论依据。利用生物信息学,分析COL1A2基因启动子区CpG岛分布及其转录因子结合位点;运用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)和RT-PCR法,分析健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中,COL1A2基因启动子区的CpG岛甲基化程度与COL1A2基因表达及乳房炎的相关性。结果表明健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中CpG岛甲基化差异不显著(P0.05),均呈低甲基化状态(50%),但位于转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点,健康组甲基化程度(30%和60%)显著高于患乳房炎组(0和10%);健康组基因表达水平显著低于患乳房炎组(P0.05)。说明,COL1A2基因在不同乳腺组织中的差异表达可能与其启动子区CpG岛转录因子SP1结合区域内的第4和第5CpG位点甲基化程度差异相关。     

月季切花RhNAC4启动子表达特性分析

为解析月季失水诱导SNAC类转录因子RhNAC4的转录调控特性,利用染色体步移的方法分离了RhNAC4的启动子,并构建含GUS报告基因的载体转化拟南芥,分析了RhNAC4的启动子表达特性。结果表明:1)在月季中分离得到RhNAC4基因5′端上游1 753bp的启动子序列;2)RhNAC4启动子序列中具有与发育、激素响应、非生物胁迫和生物胁迫等相关的顺式作用元件;3)获得了RhNAC4启动子驱动GUS基因的转基因拟南芥植株,GUS染色表明RhNAC4基因在植株不同的生长发育阶段和花器官中都有表达;4)失水胁迫、赤霉素、1-氨基环丙烷1-羧酸和甘露醇处理能够诱导RhNAC4的启动子活性,而盐和脱落酸处理对启动子活性的影响不显著。总之,月季切花失水胁迫诱导的SNAC类转录因子RhNAC4基因启动子含有逆境相关调控元件,其启动子在植株不同发育阶段和失水、乙烯等条件下具有转录活性。研究结果有助于解析RhNAC4参与月季切花失水胁迫耐性的作用机理。     

Control of genic DNA methylation by a jmjC domain-containing protein in Arabidopsis thaliana

Differential cytosine methylation of repeats and genes is important for coordination of genome stability and proper gene expression. Through genetic screen of mutants showing ectopic cytosine methylation in a genic region, we identified a jmjC-domain gene, IBM1 (increase in bonsai methylation 1), in Arabidopsis thaliana. In addition to the ectopic cytosine methylation, the ibm1 mutations induced a variety of developmental phenotypes, which depend on methylation of histone H3 at lysine 9. Paradoxically, the developmental phenotypes of the ibm1 were enhanced by the mutation in the chromatin-remodeling gene DDM1 (decrease in DNA methylation 1), which is necessary for keeping methylation and silencing of repeated heterochromatin loci. Our results demonstrate the importance of chromatin remodeling and histone modifications in the differential epigenetic control of repeats and genes.     

植物DNA甲基化研究进展

[目的]概述植物DNA甲基化的研究进展。[方法]综述了植物DNA甲基转移酶s、iRNA指导的DNA甲基化过程,阐明了DNA甲基化与其他表观遗传修饰的关系。[结果]DNA甲基化在表观遗传控制体系中起着重要作用,维持着生物进化过程中基因组和表观遗传的稳定性。RNA介导的DNA甲基化作用中s,iRNA起着不可替代的作用,但RdDM和甲基化在基因调控中的作用需要更进一步研究。[结论]全面了解DNA甲基化及其在植物发育和逆境胁迫应答中的作用,可以在转录水平上增强或抑制外源基因和内源基因沉默,便于制定更合理的改良重要转基因作物的策略。     

DNA甲基化在植物抗逆反应中的研究进展及其育种应用

DNA甲基化指通过对基因组DNA上的胞嘧啶的共价修饰,从而对生物遗传信息进行表观遗传水平上的调控,其在植物应对外界环境胁迫、调控基因的表达、稳定基因组等方面发挥重要作用。综述了DNA甲基化在植物抗逆反应中功能研究的最新进展及DNA甲基化的隔代遗传以及其在植物育种中的潜在应用,为从表观遗传水平上研究植物抗逆性的机理以及DNA甲基化在育种上的应用提供理论参考。     

不同株型玉米高产群体的质量指标

在黔西北山区特定生态条件下，采用裂区设计，对繁凑型、半紧凑型、平展型三种株型玉米品种的密度及产量结构、叶面积系数、干物重、光合势、净同化率、光能利用率、经济系数等主要群体质量指标进行了研究。结果表明，紧凑型玉米3638的高产群体密度为4100～4900株     

植物体与植物体细胞无性系发育中的DNA甲基化及其表达调控研究进展

从DNA甲基化与基因表达调控模式、DNA甲基化形式、植物发育中DNA甲基化调控、体细胞无性系发育中的DNA甲基化等方面,阐述DNA甲基化在植物体与植物体细胞无性系发育中的相关机制,评述植物体与植物体细胞无性系发育、繁殖等的相关分子机制及表观遗传机制。     

Dependence of heterochromatic histone H3 methylation patterns on the Arabidopsis gene DDM1

The Arabidopsis gene DDM1 is required to maintain DNA methylation levels and is responsible for transposon and transgene silencing. However, rather than encoding a DNA methyltransferase, DDM1 has similarity to the SWI/SNF family of adenosine triphosphate-dependent chromatin remodeling genes, suggesting an indirect role in DNA methylation. Here we show that DDM1 is also required to maintain histone H3 methylation patterns. In wild-type heterochromatin, transposons and silent genes are associated with histone H3 methylated at lysine 9, whereas known genes are preferentially associated with methylated lysine 4. In ddm1 heterochromatin, DNA methylation is lost, and methylation of lysine 9 is largely replaced by methylation of lysine 4. Because DNA methylation has recently been shown to depend on histone H3 lysine 9 methylation, our results suggest that transposon methylation may be guided by histone H3 methylation in plant genomes. This would account for the epigenetic inheritance of hypomethylated DNA once histone H3 methylation patterns are altered.     

表观遗传变异与作物遗传改良

植物天然群体中存在大量遗传变异,这些变异是随机突变和自然选择的结果,也是物种赖以生存和进化的原料.此外,不同植物种间乃至属间的天然远缘杂交是经常发生的事件,也是新种形成的重要方式,而远缘杂交为高度分歧的物种之间的基因交流提供了机会,因此也是产生新的遗传变异的重要途径.近年来的大量研究表明,植物天然群体中还存在一类不基于DNA序列差异的变异,被称为表观遗传变异(epigeneticvariation).植物发生远缘杂交以及此后的多倍体化过程可以产生大量的表观遗传变异,其遗传行为不能用经典遗传规律解释.表观遗传变异的另外一个重要来源是环境中的各种生物和非生物胁迫.研究较深入的表观遗传变异主要是编码基因和转座子DNA甲基化水平和模式的改变,但可以推测与之相关的组蛋白修饰和染色质结构也可能发生变化.目前对此类表观遗传变异的分子机理尚缺乏深入研究,但不难想像可能与各类non-coding RNA有关.这些表观遗传变异的后果是基因表达的大规模改变并由此产生新表型.作物远缘杂交育种实践表明,这些不能用经典遗传学理论解释的变异中蕴含许多在育种上有重要价值的变异并可能与杂种优势密切相关,对它们的产生机理和遗传规律的深入解析将有助于其在作物改良中的有效利用.     

Requirement of CHROMOMETHYLASE3 for maintenance of CpXpG methylation

Epigenetic silenced alleles of the Arabidopsis SUPERMAN locus (the clark kent alleles) are associated with dense hypermethylation at noncanonical cytosines (CpXpG and asymmetric sites, where X = A, T, C, or G). A genetic screen for suppressors of a hypermethylated clark kent mutant identified nine loss-of-function alleles of CHROMOMETHYLASE3 (CMT3), a novel cytosine methyltransferase homolog. These cmt3 mutants display a wild-type morphology but exhibit decreased CpXpG methylation of the SUP gene and of other sequences throughout the genome. They also show reactivated expression of endogenous retrotransposon sequences. These results show that a non-CpG DNA methyltransferase is responsible for maintaining epigenetic gene silencing.     

表观遗传学在木本植物中的研究策略及应用

表观遗传学可以解释DNA序列不改变而遗传功能改变,环境诱导的表型性状具有可遗传性的问题。介绍了表观遗传学的起源与发展,DNA甲基化（DNA methylation）、组蛋白密码(histone code)、基因组印迹(genomic imprinting)等多种表观遗传机制,并对目前木本植物的表观遗传学研究进行简要综述。由于木本植物自身基因组庞大,许多物种的全基因序列未知等原因,其表观遗传学研究滞后于拟南芥、水稻等草本模式植物。目前,仅杨树(Populus trichocarpa×P. deltoides)、辐射松(Pinus radiate D.Don.)、马占相思（Acacia mangium Willd.）等树种的基因组DNA甲基化研究取得初步进展,大多数树种尚未开展此部分研究。MSAP等木本植物上可行性技术的广泛应用,将为木本植物的表观遗传研究带来新的契机,并揭示出木本植物所特有的基因调控等表观遗传现象。