基于表达序列标签（EST）的基因克隆和基因表达分析研究进展

表达序列标签 (expressed sequence tag,EST)是在生物体特定时空表达基因的一段 c DNA序列。随着生物信息学的发展 ,EST已成为基因定位、基因克隆、基因表达分析的有力工具。文章对应用 EST克隆基因和分析基因表达的研究进展进行了综述 ,并讨论了利用 EST进行基因克隆和表达分析时应注意的问题和发展趋势     

基因克隆技术

综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或T－DNA标签法、同源序列法、表达序列标签（EST）法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素。     

高等植物基因克隆的策略

基因克隆是进行植物基因功能研究的先决条件。随着拟南芥、水稻、杨树等植物全基因组序列的公布,标志着基因组进入后基因组研究时代是分子生物学发展的必然趋势,同时为进一步克隆植物中控制重要性状的主效基因提供强大的基因组数据支撑。目前有较多的基因克隆传统及衍生技术,文章综述了图位克隆、同源克隆、转座子标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等5种应用比较广泛的基因克隆技术,并就其发展方向和策略作了展望。     

RNA分子表达技术研究进展

RNA作为基因表达的产物,在基因研究中处于重要的地位。随着生物技术的发展,越来越多的RNA分子技术被建立起来,为基因克隆和基因表达研究提供了有利的工具。根据RNA分子表达技术的技术基础,将RNA分子技术分为4类:以分子杂交为基础的差示筛选、扣除杂交、RNase保护分析、基因芯片和微阵列;以PCR技术为基础的差异显示PCR、cDNA扩增片段长度多态性;以消减杂交和PCR相结合为基础的cDNA代表性差示分析、抑制性消减杂交、交互式扣除RNA差别显示技术、全长基因获得消减杂交、基因鉴定集成法、快速消减杂交;以测序为基础的表达序列标签、基因表达系列分析、表达序列标签串联排列连接、GeneCalling等技术。     

表达序列标签(EST)分析及藻类EST文库的研究进展

随着生物信息学的发展,表达序列标签（EST）在基因组作图、克隆基因、新基因的识别、蛋白质组研究等方面具有重要作用。笔者简要介绍了EST技术的原理及其在构建遗传图谱、分离与鉴定新基因等方面的应用。综述了藻类EST文库的研究现状,并对EST的应用前景进行了展望。     

条斑紫菜孢子体cDNA文库构建及表达序列标签的初步分析

用λ噬菌体载体构建了条斑紫菜Porphyra yezoensis丝状体cDNA表达文库,并对文库进行了随机测序,对随机测序形成的719条表达序列标签(EST)序列进行了初步分析。结果表明:该文库包含1.52×106个独立克隆,重组率为88.2%;EST的冗余率为54.2%,新EST的比率为65.7%。本研究为开展条斑紫菜的功能基因克隆、分析和功能基因组学研究提供了条件。EST序列已递交Gen-Bank,编号为CX873884到CX874602。     

梅花鹿生茸区骨膜细胞基因片段测序分析

在已经构建的梅花鹿生茸区骨膜细胞cDNA表达文库的基础上对文库中的噬菌斑进行随机挑取筛选,对筛选出来的噬菌斑进行质粒亚克隆、鉴定及表达序列标签序列测定和生物信息学分析。通过随机筛选及生物信息学分析的方法发现,在梅花鹿生茸区骨膜细胞中有特殊意义的基因或者基因片段。随机挑选表达频率比较高的11个基因片段中有6个基因片段具有重要意义,对这6个基因片段进行了生物信息学分析,为进一步的鹿茸生物学研究打下了基础。     

基因表达序列分析技术(SAGE)在家蚕研究中的应用现状与前景

家蚕是鳞翅目模式昆虫,家蚕组数据库和基因表达差异分析数据库的建设为鳞翅目害虫功能基因的研究提供了一个便利的技术平台.基因表达序列分析技术(SACE)以及在此基础上发展起来的结合标签的基因序列延伸(GLGI)、长片段基斟表达序列分析(LongSAGE)等在家蚕获取基因表达谱、发现组织特异表达以及发现新基因中应用获得了很多重要的结果;众多通用SAGE数据库以及家蚕数据库为SAGE数据的生物信息学分析提供条件;以SAGR为核心的一系列技术通过定性与定量研究将把家蚕基因研究引入基因网络研究中,进行靶向定位以及辐射研究,加快家蚕后基因组时代步伐,为快速有效地发掘和研究鳞翅日害虫的功能基因提供模式价值.     

中华蜜蜂王浆多肽Apisimin基因转录、克隆与表达研究

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂头部cDNA文库并进行了测序,从8568个表达序列标签(expression sequencetag,EST)中获得96个Apisimin基因克隆,结果表明Apisimin基因是一个高丰度转录的基因。进一步对克隆分析表明该基因cDNA全长为379 nt,包含一个237 nt、可以编码78个氨基酸的ORF。推导的Apisimin蛋白N端含有一个由24个氨基酸残基组成的信号肽,后端为54残基、预计分子量为5.9kDa的成熟肽。该ORF与意大利蜜蜂和印度蜜蜂的Apisimin基因核苷酸同源性分别为100%和95%。将成熟肽编码区进行亚克隆,构建了Apisimin与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX/apisimin,并将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达。SDS-PAGE和薄层扫描表明,表达的融合蛋白分子量为31 kDa,表达量占细菌总蛋白的22.1%,约50%是可溶性的。通过亲和柱进一步纯化了表达的融合蛋白。     

应用SSH技术鉴定枳抗CTV相关基因

应用SSH 技术构建了CTV诱导的枳的正向和反向cDNA文库,经菌液PCR检测,从两个文库中分别随机 挑选了100个阳性克隆测序,共获得169条表达序列标签(ESTs).用每条EST序列对应的克里曼丁基因组预测转 录序列进行GO 功能注释,去除在两个文库中均有出现的ESTs后,共得到与已知基因具有较高相似度,涉及39个 特异性表达基因的EST83条,并对4个特异性表达基因进行了实时定量PCR验证.结果表明:CTV侵染之后,枳 启动了相关抗逆防御机制来减少伤害,木质素代谢、RNA干扰、赤霉素、生长素以及光敏色素调控可能在抗CTV 中发挥了一定作用.