免疫抑制素/卵泡抑素对家畜胚胎体外生产效率的提高

在家畜卵母细胞体外成熟培养过程中添加不同浓度的抗抑制素抗体或抗卵泡抑素抗体,通过观察卵母细胞的成熟率、激活后的卵裂率及囊胚发育率,研究免疫抑制素与卵泡抑素对家畜卵母细胞体外发育能力的影响。结果显示:就水牛、奶牛及猪而言,在卵母细胞成熟过程中分别单独添加抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体均能显著提高卵母细胞的体外成熟与卵裂率,添加的适宜浓度为50~100μg/ml。而添加抗卵泡抑素抗体还能显著提高水牛和猪的囊胚发育率。卵母细胞体外成熟期添加抗抑制素抗体与抗卵泡抑素抗体能显著提高卵母细胞的发育能力,提高早期胚胎的发育数量和质量,为改善家畜胚胎体外发育和生产提供了新方法。     

ITS、卵巢保存温度及所处性周期对黄牛卵母细胞和孤雌胚体外发育的影响

研究了ITS、卵巢保存温度及所处性周期阶段对黄牛卵母细胞体外成熟和孤雌胚体外发育的影响.结果表明,在成熟液中添加10μL·mL-1,的ITS对黄牛卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大,但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67%/32.00%);牛卵巢从采集到送达实验室保存在30～39%的灭菌生理盐水中可以获得较高的成熟率和囊胚发育率(71.34%/41.84%);黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率,但差异不显著(P>0.05).     

“胰岛素-转铁蛋白-硒钠”对山羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

[目的]为提高山羊卵母细胞及胚胎体外培养的效率,探索无血清体外培养体系。[方法]在目前卵母细胞体外成熟及胚胎培养所用的常规培养液中添加1%ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒钠)或以1%ITS分别替代2种培养液中FBS,对山羊卵母细胞及孤雌激活胚胎进行体外培养,检测ITS对其发育率的影响。[结果]添加ITS到卵母细胞成熟液中,对卵母细胞成熟率没有明显提高,但显著提高了其激活后孤雌胚胎的囊胚率(58.06%vs.48.19%);以ITS替代成熟液中FBS,取得了与FBS组相似的成熟率、卵裂率和囊胚率。添加ITS到胚胎培养液中,显著提高了山羊孤雌胚胎的囊胚率(68.30%vs.56.82%);以ITS替代胚胎培养液中FBS,卵裂率与FBS组无显著差异,囊胚率显著低于FBS组(42.33%vs.56.82%)。[结论]ITS对山羊卵母细胞体外成熟及胚胎早期发育均有促进作用;另外,ITS可以替代卵母细胞成熟培养液中的血清,作为无血清培养体系用于相关研究。     

EGCG对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对水牛卵母细胞体外成熟质量与早期胚胎发育能力的影响,为优化水牛体外胚胎生产体系及提高其体外胚胎生产效率提供参考.[方法]在水牛卵母细胞体外成熟液中添加不同浓度的EGCG,以排出第一极体为细胞核成熟标志,观察卵母细胞核成熟情况,检测MⅡ期卵母细胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量,并统计经孤雌激活及体外受精后早期胚胎的发育情况.[结果]在体外成熟液中添加10~20 μmol/L EGCG有利于水牛卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展,卵丘扩展指数(CEI)分别为2.49%和2.42%,卵母细胞成熟率(59.31%和50.98%)显著高于未添加EGCG的CK组(P<0.05,下同),MⅡ期卵母细胞的GSH含量(3.21和3.25 pmol/枚)也显著高于CK组;添加20~30 μmol/L EGCG可显著降低水牛MⅡ期卵母细胞的ROS水平.以体外成熟培养获得的水牛MⅡ期卵母细胞分别进行孤雌激活及体外受精,结果发现以在体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳,其对应的卵裂率和囊胚发育率均显著高于CK组.[结论]EGCG可用于优化水牛卵母细胞体外成熟体系,能有效提高卵母细胞的成熟率和体外发育潜力,且以水牛体外成熟液中添加10μmol/LEGCG的效果最佳.     

猪体外胚胎生产的研究进展

与牛羊等动物的体外胚胎生产（in vitro production，IVP）技术相比，猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题，这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后，从如何优化猪卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation，IVM）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）和胚胎的体外培养（in vitro culture，IVC）3个方面进行了探讨。     

改进V形孔培养法对牛胚胎体外生产效果的影响

【目的】探索V形孔培养法(WOW)、改进V形孔培养法(mWOW)和常规微滴培养法对牛胚胎体外生产效果的影响。【方法】将牛卵母细胞和受精卵分别采用常规微滴培养法(对照组)、WOW和mWOW进行体外培养,对照组每个微滴中置入20～25枚卵母细胞或胚胎,WOW和mWOW组每个V形孔中置入1枚卵母细胞或胚胎,计算卵裂率、囊胚率及受精后第6,7,8天的囊胚总细胞数和囊胚孵化率。【结果】mWOW组的卵裂率、囊胚率及第6,7,8天囊胚的总细胞数、囊胚孵化率与常规微滴组差异不显著(P0.05),但显著高于WOW组(P0.05);3个组第6,7,8天获得的囊胚总细胞数均呈逐渐下降的趋势。【结论】以TCM-199为基础培养液,用mWOW可以完成牛胚胎体外生产的全过程,且比WOW培养胚胎具有更强的发育能力和更好的质量。体外培养时,发育越快的胚胎质量越高。     

亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响

收集屠宰场水牛卵巢卵母细胞,在卵子体外成熟和受精后胚胎体外发育过程中分别添加0(对照组),10,50,100和200μmol·L-1的亚麻酸,探究亚麻酸对水牛卵母细胞核成熟率、受精卵的分裂率和植入前胚胎体外发育的影响。结果显示:在水牛卵母细胞体外成熟液中添加亚麻酸,添加浓度50μmol·L-1组的核成熟率(74.18%)显著高于对照组和其他实验组(P0.05),囊胚率(33.24%)显著高于对照组和10μmol·L-1亚麻酸组(P0.05)。在胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸组的囊胚率(34.52%)显著高于对照组和100μmol·L-1亚麻酸组(P0.05);同时在成熟液和胚胎培养液中添加亚麻酸,添加浓度200μmol·L-1组的分裂率显著高于对照组(P0.05),而各组间的囊胚率和D7囊胚比率均差异不显著。结果表明,单独在水牛卵母细胞体外成熟液和胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸能有效促进水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育。     

Effect of leptin on oocyte maturation and embryo development in vitro in buffalo (Bubalus bubalis)

[目的]探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础.[方法]分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率和体外受精胚胎发育率的影响.[结果]在水牛卵母细胞体外成熟液阶段,添加瘦素不仅能促成熟,还能提高其胚胎发育潜能;在体外受精后的胚胎培养阶段,添加瘦素也能显著提高囊胚发育率,二者的最佳瘦素浓度均为10 ng/mL.在最佳瘦素浓度(10 ng/mL)下,常规精子体外受精后的囊胚发育率从19.7％(空白对照组)提高到27.0％,分离精子体外受精后的囊胚发育率从12.3％(空白对照组)提高到17.4％.[结论]瘦素能促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育,并以添加10 ng/mL瘦素的促进效果最明显.     

瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响

[目的]探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础.[方法]分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率和体外受精胚胎发育率的影响.[结果]在水牛卵母细胞体外成熟液阶段,添加瘦素不仅能促成熟,还能提高其胚胎发育潜能;在体外受精后的胚胎培养阶段,添加瘦素也能显著提高囊胚发育率,二者的最佳瘦素浓度均为10 ng/mL.在最佳瘦素浓度(10 ng/mL)下,常规精子体外受精后的囊胚发育率从19.7%(空白对照组)提高到27.0%,分离精子体外受精后的囊胚发育率从12.3%(空白对照组)提高到17.4%.[结论]瘦素能促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育,并以添加10 ng/mL瘦素的促进效果最明显.     

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3d用CR1aa BSA培养,再用SOFaa 5?S培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50ng/mlIGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显(P>0.05)影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

血管内皮生长因子对水牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）对水牛卵母细胞体外受精的影响,为优化水牛卵母细胞体外培养体系及提高水牛体外胚胎生产效率奠定基础.[方法]以带有3层以上卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体（COCs）为材料,分别在水牛卵母细胞体外成熟液和受精液中添加重组人VEGF165,研究VEGF对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎发育的影响.[结果]在成熟液中添加10ng/mLVEGF,水牛卵母细胞的第一极体排出率由57.3％提高到72.3％,差异显著（P＜0.05,下同）;体外受精后的受精卵分裂率由41.0％显著提高到53.3％.在受精液中添加10 ng/mL VEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率由41.9％提高到63.0％,差异极显著（P＜0.01,下同）,囊胚形成率由17.0％显著提高到32.6％.在成熟液和受精液中同时添加10ng/mLVEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率和囊胚形成率由43.4％和19.0％极显著提高到64.3％和27.2％,囊胚细胞数由89.5显著提高到106.8.[结论]VEGF能促进水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎的发育,因此可将VEGF用于水牛卵母细胞体外受精体系的优化,提高水牛体外胚胎生产效率.     

磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨磷酸二酯酶抑制剂米力农(milrinone)对水牛卵母细胞成熟的影响。[方法]水牛卵母细胞分成3组,分别在含0、50、100μmol/L的milrinone的成熟液中培养16 h后,每组的一半卵母细胞用来染色,检验核成熟情况;另一半卵母细胞再在不含milrinone的成熟液中培养12 h,挑选形态正常的卵母细胞受精后培养。[结果]添加50和100μmol/L milrinone的成熟液成熟的卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)比率分别为25.9%和12.1%,显著低于对照组(76.9%);但另一半卵母细胞再培养、受精后试验组(50、100μmol/L mil-rinone)的分裂率(59.3%和61.2%)和囊胚率(35.9%和31.1%)与对照组(56.7%和28.8%)相比均无显著性差异(P0.05)。[结论]milrinone对水牛卵母细胞的成熟具有明显的抑制作用,成熟抑制解除后水牛卵母细胞仍可保持较高的发育潜能。     

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF,bovinefollicularfluid),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10?F和10%胎牛血清(FBS),以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组(P<0.05);在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1%和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10?F有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。     

猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养

【目的】本研究系统比较了体外受精胚（IVFEs）、孤雌激活胚（PAEs）以及体细胞核移植胚（NTEs）的发育率和囊胚质量，同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。【方法】利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs，开展体外培养。【结果】（1）IVFEs、 PAEs 和NTEs的卵裂率分别为72.0％，66.0％和63.5％，各组间没有显著差异(P>0.05)；囊胚形成率分别为11.0％，22.6％和16.9％，也不存在明显不同(P>0.05)；然而，在囊胚质量，即ICM细胞数/总细胞数的比例上， IVFEs和NTEs均优于PAEs（0.448％，0.356％ vs 0.122％，P<0.05）。（2）对PAEs来讲，以PZM-3为基础培养基时囊胚率明显高于以NCSU-23为基础培养基时的处理组（35.4％ vs. 22.6％，P<0.05）；而对NTEs而言， 两种培养基在支持胚胎形成囊胚方面的效果相当（26.6％ vs. 21.1％，P>0.05），虽然PZM-3培养时胚胎卵裂率显著低于NCSU-23培养组（47.5％ vs. 63.5％，P<0.05）。【结论】（1）PAEs的囊胚质量在3种来源的胚胎中最差；（2）对PAEs理想的培养基，当用于NTEs培养时却不一定是最佳的选择。     

氧分压对猪卵母细胞成熟尧受精及早期胚胎发育的影响

研究利用两种氧分压（5%和20%）培养卵母细胞并进行IVF试验,同时使用两种氧分压培养孤雌（PA）胚胎、体外受精（IVF）胚胎和克隆(NT) 胚胎,以探寻猪的最佳体外培养环境。结果显示：低氧分压不利于猪卵母细胞的体外成熟,其成熟率极显著低于高氧培养的,但对低氧培养的卵母细胞进行IVF时,其卵裂率和囊胚率均极显著高于高氧培养的卵母细胞;IVF进行精卵孵育时,低氧环境下,其胚胎卵裂率和囊胚率均显著高于高氧环境下的;PA胚胎、IVF胚胎和NT胚胎用两种氧分压培养,低氧条件下IVF胚胎的发育能力高于高氧培养的,而PA胚胎和NT胚胎差异不显著。试验结果表明,低氧培养虽不利于卵母细胞的成熟,但有利于其以后的胚胎发育,且低氧环境下IVF胚胎的发育能力高于高氧环境下的。     

序贯共培养体系对小鼠体外受精胚胎发育效果的影响

采用体外分离培养的兔输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞构建了序贯共培养体系,并与体外受精得到的受精卵进行共培养。试验结果表明,HTF液受精率显著高于T6液(P<0.05),更适用于卵母细胞的体外受精。序贯共培养体系和输卵管上皮细胞培养组2-细胞率都显著高于单独培养液组和子宫内膜细胞培养组(P<0.05),二者均可克服2-细胞阻滞。序贯共培养体系胚胎的囊胚体外发育率显著高于其他共培养组(P<0.05)。表明序贯共培养体系比单一体细胞共培养体系能更好地模拟体内环境,提高早期胚胎的体外发育率。     

不同促精子活动剂对水牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

主要探讨精子活动促进剂对水牛Bubalus bubalis卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响. 来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在体积分数为5%CO2 的培养箱中培养24～26 h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力. 试验1解冻的精子用50 g/mL的胰蛋白酶处理30 min,然后进行受精;试验2受精在含不同浓度咖啡因 (0, 2.5, 5.0 和 10.0 mmol/L)的受精液中进行;试验3在含不同浓度的钙离子载体A23187 (0, 0.1, 1.0 和 2.5 μmol/L)的受精液中进行体外受精;试验4在PHE、咖啡因和A23187不同组合(空白, PHE, PHE+2.5 mmol/L咖啡因+2.5 μmol/L A23187和PHE+2.5 μmol/L A23187) 的受精液中进行体外受精. 试验结果表明,精子用胰蛋白酶处理后的受精卵囊胚发育率显著下降 (12.5%和2.6%,P<0.05),而用咖啡因和钙离子载体A23187处理,对卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率没有明显影响. 在体外受精中PHE和钙离子载体的组合使用能提高受精卵的胚胎发育率,而高浓度的咖啡因则降低卵母细胞的卵裂率和胚胎发育率.     

不同因素对南阳牛卵泡卵母细胞体外成熟的影响

探讨了卵母细胞的不同采集方法对南阳牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，抽吸法是合适的卵母细胞采集方法。同时还探讨了卵丘细胞层数和不同激素对南阳牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明激素对南阳牛卵母细胞的成熟率和卵裂率无显著影响；具有2～8层卵丘细胞的卵母细胞获得了较高的成熟率和卵裂率；具有8层以上卵丘细胞的卵母细胞的成熟率和卵裂率比较低；裸卵和半裸卵几乎不能够成熟和卵裂。