猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。     

油茶14-3-3蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

以构建的油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子克隆技术,分离克隆1个14-3-3蛋白的全长cDNA序列,由1 156个核苷酸组成,5'非编码区57 bp,3'非编码区301 bp,开放阅读框长777 bp,编码259个氨基酸.该基因编码蛋白的分子质量为29.466 ku,等电点4.78,无信号肽序列,是非分泌蛋白,命名为Co-14-3-3a.推测的二级结构有9个α-螺旋,1个反平行的β-折叠,位于αC和αD之间.     

毛花猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶基因cDNA 片段的克隆与序列分析

毛花猕猴桃果实中Vc含量极高,为了揭示毛花猕猴桃Vc形成规律,根据已知植物的L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)基因,设计简并引物,以毛花猕猴桃新品种‘华特'果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出一条长661 bp的cDNA片段,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因编码的氨基酸序列进行亲缘分析.结果表明,所克隆片段编码氨基酸序列与美味猕猴桃GalLDH相似度高达99%,其在同源基因进化关系上聚为一类,与葡萄的GalLDH相似性高达91%,与草莓、刺梨、甘薯、温州蜜柑、拟南芥、甜瓜等植物的GalLDH同源性均在80%以上,可知克隆到的核苷酸片段确为毛花猕猴桃GalLDH基因的cDNA片段.     

黄瓜L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA全长的克隆和遗传转化

以黄瓜D08108果实为材料,根据GenBank中登录的甜瓜L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出黄瓜GalLDH的cDNA全长,GenBank登录号为 HQ446099.黄瓜GalLDH的cDNA序列全长1880 bp,包含一个长为1773 bp的完整开放阅读框,编码590个氨基酸.其核苷酸序列与已知其他植物核苷酸序列间的同源性达70%以上.共检测得到5棵转基因植株     

松墨天牛葡萄糖-6-磷酸异构酶基因克隆及序列分析

[目的]克隆松墨天牛(Monochamus alteratus)葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)基因cDNA序列,探究其分子特征,为深入研究松墨天牛GPI的分子功能打下基础.[方法]采用RACE技术克隆松墨天牛GP基因cDNA序列,并对该序列及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析.[结果]克隆并鉴定松墨天牛GPI基因,命名为MaGPI(GenBank登录号:KU323592),该基因序列长1038bp,共编码279个氨基酸.同源比对分析发现,松墨天牛与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的同源性最高,达90%,而与其他昆虫的同源性在76%以上.系统发育进化树分析结果表明,松墨天牛与赤拟谷盗在同一分支,与家蚕(Bombyx mori)相隔最远.MaGPI为亲水蛋白,含有5个功能位点:活性位点、变构位点、活性部位盖子和两个多肽结合位点.[结论]明确了MaGPI的核苷酸序列及编码蛋白特征,为进一步研究MaGPI的分子功能提供依据.     

二色补血草海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的克隆及分析

以二色补血草叶片组织为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为2.0×106pfu,重组率为95%,平均插入片段为0.8 kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu.mL-1。通过随机测序从文库中获得的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因的全长cDNA序列,该序列长1 986 bp,其中5’非翻译区163 bp,3’非翻译区680 bp,开放读码框长1 143 bp,编码380个氨基酸,蛋白分子质量为42KD,理论等电点为6.68。海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶在海藻糖合成过程中起关键作用,该基因的克隆为研究海藻糖在二色补血草中的合成奠定了基础。     

香蕉14-3-3蛋白基因Ma-14-3-3d的克隆及序列分析

[目的]克隆分析香蕉中14-3-3蛋白编码基因。[方法]采用PCR与RACE技术相结合的方法克隆香蕉14-3-3基因,并进行CDNA测序及同源性分析。[结果]所克隆cDNA全长866 bp,编码197个氨基酸残基,具有植物14-3-3蛋白基因的特征结构域,并与其他植物来源的14-3-3蛋白具有很高的序列相似性,将其命名为Ma-14-3-3d(Musa acuminate14-3-3gene)。[结论]Ma-14-3-3d蛋白与来源于单子叶植物的14-3-3蛋白位于同一进化枝上。     

杜仲2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶基因全长cDNA克隆与序列分析

2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合酶(MDS)基因曾被认为是调控植物2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径的一个关键节点。为解析杜仲MDS基因序列信息和预测基因功能,以叶片cDNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术分离出杜仲MDS基因的cDNA克隆,并通过一系列生物信息学方法进行序列分析。结果表明:EuMDS基因cDNA全长976 bp,5′端非编码区长119 bp,3′端非编码区长146bp,编码236个氨基酸。推导EuMDS氨基酸序列中包含转运肽序列(A1~A56)以及多个植物MDS蛋白保守的功能位点(A84,A87,A89,A121,A213,A217,A221,A223,A228)。推导EuMDS蛋白二级结构中α-螺旋占40.3%,β-折叠占13.6%,螺环结构占46.2%。推导EuMDS蛋白三级结构由3个亚单位组成,并相互围绕形成1个分子内腔。系统进化分析表明EuMDS蛋白与啤酒花MDS蛋白亲缘关系最为接近。预测所克隆的EuMDS基因在杜仲萜类生物合成中发挥重要功能。     

棉铃虫α-微管蛋白基因的克隆、序列分析及表达模式检测

【目的】克隆及序列分析棉铃虫（Helicoverpa armigera）α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因（HeTubA）,采用荧光定量PCR（QRT-PCR）技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因（GenBank登录号为JQ069957）。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分析表明,HeTubA与八字地老虎（Xestia c-nigrum）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）及家蚕（Bombyx mori）的α-微管蛋白氨基酸序列同源性最高,α-微管蛋白基因在长期进化中非常保守。荧光定量PCR表明,棉铃虫α、β-微管蛋白基因不具有生长发育阶段及成虫器官特异性,且二者均在复眼表达高,腹部表达低;HeTubA在末龄幼虫期和蛹期高水平表达,HeTubB在末龄幼虫期和成虫期高水平表达。【结论】成功克隆了棉铃虫α-微管蛋白基因,对2种微管蛋白基因的表达模式进行了检测,进一步进行了蛋白质3D结构的构建,可用于深入研究2种微管蛋白基因的功能及开发新型杀虫剂。     

甘蔗14-3-3基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗14-3-3基因并预测分析其编码蛋白的结构,为研究甘蔗基因功能和代谢调控机制提供参考.[方法]以水稻14-3-3基因为模板,BLAST甘蔗EST数据库,依据序列拼接结果及RT-PCR技术获得编码甘蔗14-3-3蛋白的全长基因,并用生物信息学方法对该蛋白的二级、高级结构和功能活性位点进行预测.[结果]克隆得到长784bp的甘蔗14-3-3基因,最大开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸;该蛋白的分子量与理论等电点分别为28.88 kDa和4.79.蛋白聚类分析结果表明,甘蔗14-3-3蛋白与水稻、高粱、玉米14-3-3蛋白的同源性均在90％以上.Cn3D V.4.1预测位于第3和第5两个二聚体上的Lys-50、Arg-57、Arg-131和Try-132组成一个凹穴,是结合靶蛋白的作用面;第60、65、188、218位的4个丝氨酸是磷酸化的活性位点.实时定量PCR检测结果表明,14-3-3基因在甘蔗不同组织中均有表达,在茎和分生组织中14-3-3基因高丰度表达,可能与糖代谢和细胞分裂的调控相关;而在根中可能参与矿物元素的吸收和代谢.[结论]甘蔗14-3-3基因可作为信号转导调控蛋白的候选基因之一.     

红河大翼橙的遗传多样性分析*

 在100个随机引物中选取了13个可扩增出多态性产物的引物,对红河大翼橙6个居群的120个体进行了ISSR扩增,试验结果表明,红河大翼橙居群之间表现出较高水平的遗传分化,为柑橘遗传资源利用和保护方面提供了分子水平上的依据。     

柑橘产业中病害问题及解决途径

综述了柑橘产业中主要病害问题,并提出了通过常规手段和生物技术手段(基因工程、分子标记、细胞工程等)加以解决的措施。     

宽皮柑橘资源评价·利用与研究进展

着重概述了几种主要宽皮柑橘的特点,以及在种质资源保存、鲜食、加工和旅游观光等方面的用途。介绍了现代生物技术手段,如分子标记技术(RFLP、RAPD、AFLP、RAMP、REMAP等)、基因工程技术及细胞工程技术在宽皮柑橘中的研究进展。     

柑橘类植物GPAT基因片段克隆和SNP分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因是与植物抗冷性强弱密切相关的基因。根据已报道的各种植物GPAT基因的氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从琯溪蜜柚、马家柚、莽山野橘等8种柑橘类植物中克隆得到315bp的GPAT基因片段。使用DNA Star5.0软件对8个片段序列进行同源性比较,8个片段的核苷酸同源性高达97.8%,与其它植物GPAT基因核苷酸序列的同源性都在72.5%以上;经过氨基酸序列推导,每个GPAT基因片段分别编码105个氨基酸,8个片段的氨基酸同源性为95.2%,与其它植物GPAT基因的氨基酸序列同源性在68.9%以上。试验克隆所得8种柑橘类植物GPAT基因片段序列存在明显的单核苷酸变异,在14个核苷酸位点存在SNPs(single nucleotide polymorphisms),导致6个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/22.5bp,核苷酸变异度为4.45%,氨基酸变异度为5.71%。采用NJ聚类法对克隆片段的核苷酸序列进行了遗传多样性分析。     

酸橙ACC氧化酶基因片段克隆及序列分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶是植物乙烯合成的1个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据已报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,以酸橙叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到1个834 bp的基因片段。克隆了酸橙1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因cDNA片段,将片段序列在NCB I网站上进行同源性搜索,显示的皆为不同植物的ACC氧化酶基因,因而认为所克隆的片段就是酸橙ACC氧化酶基因;并运用DNAStar5.0软件进行序列分析,推导的氨基酸序列为278个残基;具有所有植物ACC氧化酶基因共有的保守区域;与多种植物的ACC氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在72%和70%以上。     

晚熟温州蜜柑NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

为加深对柑橘黄龙病抗性机理的了解和为黄龙病抗性基因的克隆提供依据,根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以柑橘黄龙病抗性品种"晚熟温州蜜柑"为供试材料,对其基因组DNA进行PCR扩增、克隆和序列测定,结果共获得17条抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),其在NCBI中的登录号为KJ019189~KJ019199,KR815564~KR815569。序列分析表明,这17个RGAs与甜橙、柚等柑橘属中推测的一些抗病蛋白基因或其他相关蛋白基因具有显著高的同源性。其中一些RGAs与拟南芥抗霜霉病RPP13基因、柑橘抗衰退病毒基因Ctv或烟草抗TMV基因N具有51.7%~79.0%的氨基酸序列同源性。依据论文结果,笔者认为,晚熟温州蜜柑中存在较丰富的NBS-LRR类抗病基因,但具体哪些病基因与抗黄龙病相关尚需进一步研究。     

福州地区柑橘种质资源的ISSR分析

研究利用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记技术对21份福州地区柑橘种质资源进行遗传多样性分析,以期为福州地区柑橘的品种鉴定及育种提供理论依据和技术支持。试验从27条ISSR引物中筛选出多态性好、条带清晰的14条引物,对供试材料进行遗传多态性分析。获得162条总条带,其中多态性条带129条,多态位点百分率为79.63%;聚类结果显示21份资源可分为5个组,13份福橘被聚为同一组,进而可划分为4个亚组。ISSR标记能较好地区分福州地区柑橘资源,且福州柑橘地方资源遗传多样性丰富。     

Molecular Phylogeny of the ＂True Citrus Fruit Trees＂ Group （Aurantioideae,Rutaceae） as Inferred from Chloroplast DNA Sequence

The genus Citrus L.has a long controversial taxonomy history,and a well-resolved molecular phylogeny of the "true citrus fruit trees" group in the future will provide new information for advancing breeding techniques and developing better conservation strategies.In the present study,three cpDNA fragments(TrnL-TrnF,PsbH-PetB,and TrnS-TrnG)of 30 genotypes chosen from the six genera of the "true citrus fruit trees" group were analyzed.A molecular phylogenetic tree of the "true citrus fruit trees" group was reconstructed based on plastid DNA sequences.The results confirmed that the "true citrus fruit trees" group was monophyletic,and thereby the group was divided into genera as previously suggested based on morphological characters.The cpDNA data also suggested that Poncirus might be the first genus separated from the other five genera in the group.The genus Fortunella were of hybrid origin and Citrus might be as its putative paternal parent.The genera Microcitrus,Eremocitrus,and Clymenia were possibly monophyletic and their common ancestor might branch out from Citrus.Furthermore,the phylogenetic relationships within the Citrus genus were discussed.     

柑橘类植物SOD基因片段的克隆和SNP分析

[目的]对柑橘类植物遗传多样性进行精确分析研究。[方法]根据已报道的各种植物Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列上前后2个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从岭南沙田柚、柠檬等6种柑橘类植物中克隆得到长426bp的Mn/Fe-SOD基因片段,并对所得序列进行了SNP分析。[结果]柑橘类植物核苷酸同源性高达97.2%,与其他植物Mn/Fe-SOD基因核苷酸序列的同源性都在77.7%以上;经过氨基酸序列推导,每个基因片段分别编码142个氨基酸,6个基因片段的氨基酸同源性为97.9%,与其他植物Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列同源性在79.0%以上。在Mn/Fe-SOD基因片段中有18个核苷酸位点存在SNPs,导致3个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/23.7bp,核苷酸变异度为4.23%,氨基酸变异度为2.38%。[结论]该研究为丰富构建柑橘类植物基因图谱标记和抗逆性状的遗传标记奠定了基础。     

杜仲糖基转移酶基因EuCGT1克隆及序列分析

本研究以杜仲(Eucommia ulmoides)7月雌株新生幼枝的树皮为材料,根据杜仲转录组测序数据中筛选的一个糖基转移酶基因(CGT)片段信息设计引物,采用SMART RACE技术,克隆了5’-端1432bp和3’-端535 bp cDNA片段,测序拼接后获得全长1 583 bp的杜仲CGT的cDNA序列。分析结果表明,该cDNA开放阅读框长1 464 bp,编码487个氨基酸,命名为EuGT基因。EuGT在NCBI中经blastn比对,显示序列与甜橙和草莓的UDP-葡萄糖基转移酶基因同源性分别为72%和67%;推测的氨基酸序列经blastp和CDD比对,显示序列与UDP-葡萄糖类黄酮3-O-糖基转移酶-6同源,其中含有UDP-葡萄糖基转移酶的保守域(pfam00201),初步推测EuCGT1蛋白属于糖基转移酶家族。本研究克隆的EuGT基因是首次从杜仲中克隆的糖基转移酶家族基因。以EuCGT1基因构建的植物表达载体pSH-35S-EuCGT1采用农杆菌介导法遗传转化烟草,获得了含EuCGT1基因的转基因烟株,移栽生长1个月的转基因烟草植株在表型上与野生型烟草无明显差异。