根癌农杆菌介导转化籼稻影响因素的研究

选用我国籼型杂交稻中的几个重要亲本 ,以携带有双元载体 p CAMBIA1 3 0 1的根癌农杆菌 EHA1 0 5为载体 ,以GUS基因的瞬间表达为依据 ,研究根癌农杆菌介导转化籼稻的影响因素 ,确立对转化频率有重要影响的几个条件。结果表明 :经短期预培养 (4～ 5d)的幼胚是较为理想的转化受体材料 ;在共培养基中添加较高浓度的乙酰丁香酮 (3 0 0～ 4 0 0μmol/ L)可提高 GUS基因的瞬间表达频率 ;以 CC培养基作为共培养后抗性愈伤筛选的基本培养基有利于抗性愈伤组织的筛选培养。按此确立的条件 ,在特青、龙特甫 (B)、珍汕 97(B)、盐恢 559等籼稻品种或亲本中的 GUS瞬间表达率高达 80 % ,抗性愈伤组织转化率高达 70 %     

用根癌农杆菌介导获得籼稻转基因植株

用携带p13W4质粒的根癌农杆菌EHA105感染籼稻龙特甫品种的幼胚愈伤组织，经共培养并在潮霉素25－50mg/L浓度条件下筛选2－3次，获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织，其愈伤组织转化频率为25.3%,将抗性愈伤组织转入分3化培养基培养形成植株，经GUS活性测定和PCR检测，结果证明外源基因确已导入这些转基因植株之中。     

籼稻品种Kasalath遗传转化条件的研究

[目的]探索籼稻品种Kasalath的遗传转化条件,为该品种进一步的分子生物学研究奠定基础。[方法]以籼稻品种Kasalath的愈伤组织为转化受体,应用根癌农杆菌介导法进行遗传转化;从共培养方式、共培养时间、共培养后处理方法等方面优化遗传转化体系。[结果]当愈伤组织与农杆菌共培养时间为2d时的转化效果最好,抗性愈伤组织获得率达84.1%,转化菌的转化率达到73%,且共培养时愈伤组织是否直接接触培养基对转化无明显影响。[结论]遗传转化成功地将外源基因OsMAPK2整合到水稻基因组中。     

籼稻品种Kasalath遗传转化条件研究（摘要）

[目的]探索籼稻品种Kasalath的遗传转化条件,为针对该品种进一步的分子生物学研究奠定基础。[方法]以籼稻品种Kasalath的愈伤组织为转化受体,应用根癌农杆菌介导法进行遗传转化;从共培养方式、共培养时间、共培养后处理方法等方面优化遗传转化体系。①共培养条件的优化：愈伤组织接入共培养基时分2组,1组加1层灭菌滤纸,1组不加。②共培养时间的优化：分别于农杆菌液侵染愈伤1,2,3,4 d观察。③共培养后处理方式的优化：方式1,将共培养后的愈伤组织用灭菌蒸馏水冲洗多次至水清亮无混浊悬浮物,然后用含有羧苄青霉素的灭菌蒸馏水浸泡30 min,放置在有3层滤纸的灭菌培养皿中短暂干燥。方式2,将共培养后的愈伤组织置于带2层滤纸的灭菌培养皿中干燥,干燥3 d后取出。2种方式干燥后的愈伤组织均接入含40 mg/L潮霉素筛选压的筛选培养基上,筛选2次,每次2～3周。[结果]Kasalath的愈伤组织经农杆菌侵染后,经过共培养,再经筛选培养出抗性愈伤直至分化成转化苗,共培养时问对于转化效率的影响较大。如果共培养时间过长,将导致农杆菌过度生长,随后的筛选培养中即使加入抗菌的羧苄青霉素也无法抑制其生长,愈伤组织褐化死亡率增大。而共培养时间太短,则影响农杆菌Ti质粒T-DNA的转移,影响转化效率。该研究中当愈伤组织与农杆菌共培养时间为2 d时的转化效果最好,抗性愈伤组织获得率达84.1%,转化菌的转化率达到73%,且共培养时愈伤组织是否直接接触培养基对转化无明显影响。利用PMCG161载体引物PMCGF和PMCGR对所获得的部分转化苗进行PCR检测,23株转化苗中有13株扩出了预期的约750 bp条带,且为阳性转化苗,表明外源基因OsMAPK2已整合到水稻品种Kasalath的基因组中。[结论]经愈伤组织的诱导、共培养、筛选、预分化、分化等步骤,最终成功实现了农杆菌介导的OsMAPK2基因对籼稻品种Kasalath的遗传转化。     

农杆菌介导北方粳稻转化体系的研究

通过农杆菌介导的方法将Bar-Bt基因（抗除草剂基因和抗虫基因构建在同一载体上的双基因）整合到北方优质粳稻龙稻6号、松粳9号等品种中;分别以供试品种的幼胚和成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携带有Bar-Bt基因双元载体PCAMBIA1301号的根癌农杆菌EHA105为载体,GUS基因的瞬时表达率为衡量指标,对影响农杆菌介导的龙稻6号、松粳9号等品种的转化效率的主要因素进行了研究。结果表明：农杆菌侵染愈伤组织的菌液浓度以D（600nm）=0.8～1.0较为适宜,最佳共培养时间为2～3 d,预培养时间为5 d,共培养培养基中添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的转化效率有明显提高。     

巴西橡胶树抗氧化胁迫基因——超氧物歧化酶基因的遗传转化及植株再生

本研究采用农杆菌介导法成功实现巴西橡胶树（Hevea Brasiliensis Muell．Arg）的遗传转化及植株再生。试验中以橡胶树未成熟花药的愈伤组织为转化材料，并通过与含有巴西橡胶树超氧物歧化酶基因（HbSOD）表达载体的根癌农杆菌进行共培养最终获得转基因植株。所用表达载体为CaMV 35S启动子控制下的组成型质粒表达载体．其中带有GUS（β-葡糖醛酸酶，uidA）报告基因，nptⅡ（新霉素磷酸转移酶）选择性标记基因，以及HbSOD（巴西橡胶树超氧物歧化酶）目的基因。为了进一步优化转化体系，试验中还就共培养时间，共培养基成分。以及卡那霉素浓度等因子对转化效果的影响进行了系统性的比较研究和分析。其结果显示，在卡那霉素浓度为300mg／L的培养基上存活的转化愈伤呈现出强烈的GUS阳性反应。之后，这些转化愈伤在含有2．0mg／L精胺及0．1mg／L脱落酸的MS2培养基上再生出体细胞胚胎。然后。成熟胚胎在附加0．2ms／L赤霉酸、0．2mg／L细胞分裂素。以及0．1mg／L吲哚-3-乙酸的MS4培养基上得以继续萌发并进一步发育成小植株。试验中所得转化频率为锄。转化植株在形态上与非转化植株相似。GUS组织学分析显示，GUS基因在转基因植株的胚胎及叶片中均得到表达。PCR（多聚酶链式反应）扩增及基因组Southern印迹杂交分析进一步证实了转基因植株基因组中uidA、nptⅡ及HbSOD基因的存在。     

农杆菌介导水稻转化条件的优化

应用TAC（transformation-competition artificial chromosome)载体和pCAMBIA1300分别与农杆菌LBA4404组合转化水稻成熟胚愈伤组织，探索了农杆菌转化的有关因素。结果表明：共培养培养基上铺上1张滤纸有利于控制农杆菌的过度生长；粳稻品种转化率明显高于籼稻；干燥处理能有效杀死农杆菌，并有利于提高转化率，预再生可提高抗性愈伤组织的再生率而提高转化率。     

优化农杆菌介导的月季遗传转化系统的研究

为了建立月季品种‘萨蔓莎’根癌农杆菌介导的遗传转化系统，我们通过衡量GUS基因瞬间表达水平，探讨了各因子对基因转化的影响.结果表明:外植体、光照条件、共培养培养基中无机盐含量及乙酰丁香酮（AS）含量是重要的影响因子；共培养时间、共培养温度及农杆菌菌液浓度对根癌农杆菌的生长以至基因转化有重要影响.优化后的转化条件为:将月季胚性愈伤组织与OD６００值为0.5～0.8的农杆菌菌液侵染20min，然后在含300μmol/L AS并且无机盐减半的MS培养基上黑暗、23℃条件下共培养3d.      

农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立

以籼稻恢复系明恢86为材料,探讨受体材料、愈伤代龄、预培养时间、筛选时间等因素对转化效率的影响,并建立了高效稳定的农杆菌介导籼稻转化体系.转化技术参数如下,水稻花后15 d幼胚诱导的胚性愈伤(2~6代),作为转化受体材料,经4 d预培养,农杆菌侵染30 min,共培养3 d后,在30 mg@L-1潮霉素筛选出抗性愈伤,抗性愈伤经50 mg@L-1潮霉素筛选10~15 d后立即分化,幼胚的胚性愈伤转化频率可达6.98%,并且能够周年转化.     

共培养基对甘蓝型油菜下胚轴GUS瞬间表达及转化效率的影响

为提高根癌农杆菌介导的甘蓝型油菜遗传转化效率,以甘蓝型油菜"湘油15"下胚轴为外植体,以MS为基本培养基,研究了共培养基中α-NAA和6-BA浓度对根癌农杆菌介导法转化甘蓝型油菜过程中下胚轴GUS基因瞬间表达及转化效率的影响。结果表明,共培养基对GUS基因的瞬间表达和稳定表达具有重要影响,但共GUS基因的瞬间表达率和转化效率之间没有明显的线性关系。     

美味猕猴桃遗传转化研究初报

以美味猕猴桃东山峰７８－１６的茎段愈伤组织块为受体，根癌农杆茵（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（ｐＢＩ１２１）作介导菌，将愈伤组织块与农杆菌共培，扫描电镜观察农杆菌在愈伤组织块细胞表面上的附着情况；将共培后的愈伤组织块转移到含５０μｇ／ｍＬ的卡那霉素（Ｋａｎ）筛选培养基上筛选，获得抗Ｋａｎ的抗性苗。抗性苗的获得初步证明外源新霉素磷酸转移酶Ⅱ（ＮＰＴⅡ）基因已整合到受体基因组中并得以表达。     

根癌农杆菌介导苹果愈伤组织遗传转化体系的优化

[目的]以'王林'苹果愈伤组织为转化研究的材料,在已经建立的遗传转化基础上,优化根癌农杆菌介导的'王林'愈伤组织的遗传转化系统.[方法]在遗传转化的过程中,通过对根癌农杆菌的侵染时间、共培养以及抗性的选择,优化遗传转化体系并且增加转化效率.[结果]选择生长20 d的愈伤组织,在根癌农杆菌OD600=0.8时侵染20 min,共培养3d、转入卡那霉素30 mg/L和头孢噻肟250 mg/L的培养基上进行筛选,可显著提高遗传转化效率.[结论]将McmiR 399d作为标记基因进行转化,优化苹果'王林'愈伤组织的遗传转化系统,从而得到过表达和沉默的McmiR399d'王林'愈伤组织.     

根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

宁夏水稻农杆菌转化组培体系的建立

高效的组培再生体系是水稻农杆茵遗传转化的基础,以宁夏4个主栽水稻品种为受体材料,对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的几个主要因素进行了研究,结果表明:花药和幼胚的愈伤组织诱导率高于成熟胚,而且愈伤状态好,有利于转化;在共培养基上铺上1张灭菌滤纸共培养时,农杆茵在培养基及受体材料表面上不会过度生长.共培养条件以26℃,共培养2天的抗性愈伤频率最高;共培养后不经洗茵处理直接进行筛选的抗性愈伤频率高于洗茵处理;经过预分化培养可提高分化率;干燥处理不仅可以有效杀死农杆茵,而且可以改善愈伤组织状态,提高转化率.初步建立了宁夏几个主栽品种的农杆菌转化体系.     

根癌农杆菌介导的章丘大葱遗传转化体系研究

建立了根癌农杆菌介导转化章丘大葱愈伤组织的体系,即用OD600值为0．6的农杆菌悬浮液浸泡大葱愈伤组织,侵染30min,共培养3d时的转化效果最佳。获得的愈伤组织GUS基因瞬时表达率为33．92％,PER检测结果表明,转化率为0．59％。     

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。     

灿稻不同品种的遗传转化和植株再生

用携带水稻蜡质基因反义RNA片段的p13W4质粒的根癌农杆菌EHA105，分别感染灿稻品种龙特甫B、协青早B、珍灿97B和Ⅱ-32B的幼胚愈伤组织，经共培养和潮霉素25～50mg/L浓度下的二次筛选后，获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织，抗性愈伤组织的频率在20.1%～27.1%之间；抗性愈伤组织经分化培养，分化频率在12.0%～21.2%。品种间绿菌分化情况存在较大差异，龙特甫B的抗性愈伤组织分化成绿苗的频率为8.8%；珍汕97B的抗性愈伤组织虽能分化，但是，无法获得绿苗。 对转基因植株分别进行了GUS活性测定和PCR检测。结果显示：获得的转基因植株，92%的植株GUS检测呈阳性反应，并能正常结实，在T1种子的胚乳中也能检测到GUS染色的分离，证明外源基因确已导入这些植株中，而且，能正常遗传。在抗性愈伤组织的分化中，试验了潮霉素对分化的影响，结果显示：不添加潮霉素，能明显地提高绿菌频率，但转基因植株的可靠性也随之下降。     

籼粳稻对农杆菌遗传转化反应的差异及提高转化率的研究

通过对粳稻品种日本晴及5个籼稻品种的研究,发现籼稻、粳稻在成熟胚愈伤组织培养、农杆菌遗传转化的最适条件方面存在差异.在MS,CC,NB培养基上,日本晴的愈伤组织诱导率达86.37%以上,远高于各籼稻品种;与农杆菌液的共培养时间,籼、粳稻均以3 d为宜;转化后的籼稻抗性愈伤组织用40 mg/L的潮霉素筛选效果较好,日本晴则需用50 mg/L的潮霉素筛选;幼苗生根阶段,籼稻的潮霉素适宜质量浓度为20～30 mg/L,日本晴的潮霉素适宜质量浓度为50 mg/L;日本晴的gus基因瞬时表达率强于各籼稻品种,hpt基因转化率也高于各籼稻品种.     

用农杆菌将Bt基因导入水稻愈伤组织的研究

从水稻成熟胚诱导出的愈伤组织经继代培养后可以产生大量的胚性愈伤组织。通过采用农杆菌共培养法转化上述胚性愈伤组织,在附加羧苄青霉素Ｃｂ（５００ｕｇ／ｍＬ）和卡那霉素Ｋｍ（５０ｕｇ／ｍＬ）的选择培养基上进行抗性愈伤组织的筛选,在附加羧苄青霉素Ｃｂ（５０ｕｇ／ｍＬ）和卡那霉素Ｋｍ（２５ｕｇ／ｍＬ）的分化培养基上诱导抗性芽。ＧＵＳ酶活性检测和ＰＣＲ检测结果均为阳性,证明外源目的基因（Ｂｔ）已在寒地水稻抗性愈伤组织中整合并表达。抗性再生植株的ＧＵＳ酶活性及ＰＣＲ检测正在进行中。     

结缕草农杆菌介导遗传转化中辅助处理方法的改良

以结缕草愈伤组织为试材,利用农杆菌介导法时包括辐照、愈伤组织状态、共培养条件及负压处理等辅助处理方法对愈伤组织瞬间表达频率的影响进行研究。结果表日日：2Gy的辐照剂量利于提高瞬间表达频率;1-2个月的愈伤组织适于转化;全光照的共培养条件下瞬间表达频率高于16／8h光照培养和暗培养条件下瞬间表达频率;农杆菌与愈伤组织混合培养时给予适当的负压条件可提高愈伤组织瞬间表达频率和存活率。