白化体虹鳟眼球色和体色遗传的初步研究

采用反证法对从日本引进的白化体虹鳟Oncorhyncus mykiss的体色、眼球色两对性状的遗传规律进行了初步研究。设计了试验一:白化体虹鳟与野生型虹鳟正、反交试验(正交白化体虹鳟♀×野生型♂,反交白化体虹鳟♂×野生型♀),同时进行了这两种亲本的自交等4个组合。在试验一的基础上,又设计了试验二:正交F1和反交F1自交,白化体虹鳟自交组与正、反交F1测交以及野生型虹鳟自交组与正、反交F1自交、测交等20个组合,对各个交配组合的后代的两对性状的表现型数据进行了统计分析和卡方检验,结果表明:控制黄体色的基因对野生体色基因为显性,控制红眼球色的基因对野生眼球色基因为隐性,证实了引自日本的白化体虹鳟的体色基因型属于显性纯合,而眼球色基因型为隐性纯合;白化体虹鳟的体色遗传符合孟德尔遗传规律,如果考虑了等位基因的异位上位效应,根据白化体虹鳟与野生型虹鳟正、反交F1及其自交的F2眼球色的表现型比率,说明白化体虹鳟眼球色的遗传方式也符合孟德尔遗传规律。     

鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

[目的]研究HSP70是否可作为鲤鱼养殖中的应激监测指标。[方法]根据鲤鱼HSP70序列（AY120894）设计并合成1对引物,提取鲤鱼肝脏组织总RNA,通过RT-PCR方法克隆得到鲤鱼HSP70部分cDNA片段,然后检测其在鲤鱼心脏、肠、粘液、性腺、鳔、鳃、鳍等不同组织中的表达差异。[结果]RT-PCR扩增获得鲤鱼HSP70基因cDNA部分序列为480 bp。将测序后推测的氨基酸序列与其他种类的鱼进行同源性比较,结果发现与鲤鱼、斑马鱼、虹鳟、牙鲆、剑尾鱼、鲋鱼的同源性依次为96%、98%、98%、96%、96%、96%。HSP70在鲤鱼8个组织中均检测到表达,其中在心脏中表达最高,其次是鳔、鳍,二者之间无显著差异（P〉0.05）,在肠、粘液与脂肪3个组织中的表达无显著差异（P〉0.05）,但显著高于在性腺与鳃中的表达水平（P〈0.05）。[结论]HSP70作为鲤鱼养殖中应激程度、应激能力、健康状况检测的分子标记物是可行的。     

氨氮急性胁迫下二、三倍体雌性虹鳟应激耐受性比较

在集约化养殖条件下,当受到环境因子或人为因子胁迫时,三倍体雌性虹鳟死亡率明显高于二倍体雌性虹鳟,此现象与其应激耐受性有关.为了解氨氮急性胁迫下二倍体和三倍体雌性虹鳟应激耐受性差异,采用96 h半静态毒性试验法,在氨氮浓度分别为16.42、24.3、36.06 mg·L-1胁迫下,对二者急性毒性效应、血液生理生化指标以及肝脏非特异性免疫相关基因表达开展研究.结果表明,与二倍体雌性虹鳟相比,三倍体雌性虹鳟毒性反应较迅速且强烈,其血液中白细胞(WBC)、皮质醇(COR)和丙二醛(MDA)含量高;红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性低;鳃组织炎性细胞浸润,黏液细胞增多,鳃小片黏连,组织损伤严重;三倍体雌性虹鳟肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8基因表达量高于二倍体雌性虹鳟,HSP70、HSP90基因表达量低于二倍体雌性虹鳟.可知,三倍体雌性虹鳟对氨氮胁迫反应较二倍体雌性虹鳟更为敏感,其抗氧化及携氧调节能力较弱,即三倍体雌性虹鳟对氨氮急性胁迫应激耐受性更差.     

牙鲆精氨酸酶基因片段的克隆及序列分析

根据Gen Bank中虹鳟、大菱鲆、斑马鱼及其他生物的精氨酸酶基因序列设计并合成一对引物,并提取变态期牙鲆仔鱼总RNA作为模板进行RT-PCR,得到一条c DNA片段。将产物连接到T载体中,转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将DNA测序所得到的基因序列翻译成蛋白序列和已知的大菱鲆、鲤鱼、虹鳟、斑马鱼的精氨酸酶基因序列进行同源性分析。结果显示,利用RTPCR的方法扩增出一条284 bp的目的基因片段,比对结果发现,其与大菱鲆、鲤鱼、斑马鱼以及虹鳟精氨酸酶基因蛋白序列的同源性分别为96%、85%、84%和82%。对蛋白序列进行生物信息学分析发现,整个蛋白序列中无信号肽,无糖基化位点,无跨膜结构域,但含有一个典型的arginase结构。在N-端第38~44、57~64、71~76、89~94区段有β-折叠中心;第7~18、50~52、81~87区段可能形成α螺旋区域。Arg蛋白N端第37~45和第74~77区段为优势抗原表位区域。     

长丝裂腹鱼MyoD1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆长丝裂腹鱼的MyoD1基因,并对其进行序列分析。[方法]根据鲤鱼(Cyprinus carpio)的MyoD1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对长丝裂腹鱼MyoD1的全长cDNA序列进行扩增,并对该基因编码氨基酸的理化性质及同源性进行预测和分析。[结果]试验获得了包括完整ORF的长丝裂腹鱼MyoD1基因,该序列长957 bp,编码274个氨基酸,具有MRFs家族基因的典型性碱性bHLH结构;该MyoD1序列与齐口裂腹鱼、鲤鱼、斑马鱼和虹鳟等的MyoD1序列同源性较高,与人、猪、牛等哺乳动物的同源性较低。[结论]该研究为长丝裂腹鱼的肌肉发育和肉质特性形成的分子机制研究提供了基础数据,同时为青藏高原冷水鱼资源的利用与保护提供了指导意义。     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10 cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10 cDNA共1 117 bp,包含55 bp的5'端非编码区,一个540 bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522 bp的3'端非编码区,其中,3'非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

牙鲆Follistatin基因启动子克隆与分析

为研究海水鱼中Follsitatin基因的组织表达特异性,利用PCR方法获得牙鲆Follistatin基因启动子并进行序列分析,用RT-PCR和显微注射方法研究Follistatin基因与肌肉发育的关系.结果表明,所获得的启动子含有USF、F47、MyoD、NF-Y等多种转录因子结合位点;在牙鲆成体组织中,Follistatin基因在体肾、肠、心脏、头肾、脾中有表达,而在肌肉和肝脏中没有表达;显微注射证明Follistatin基因参与了肌肉的早期发育.     

鲤鱼白细胞介素10(IL-10)基因cDNA克隆及序列分析(英文)

[目的]获取鲤鱼全长IL-10(interleukin 10)cDNA,并对其序列进行分析。[方法]利用DD-RTPCR(differential display RT-PCR)方法获得差异表达IL-10cDNA片段,以地高辛标记做为探针,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,克隆鲤鱼IL-10全长cDNA,并对该序列进行序列分析和同源性比较。[结果]鲤鱼全长IL-10cDNA共1117bp,包含55bp的5’端非编码区,一个540bp的编码179个氨基酸的开放阅读框及522bp的3’端非编码区。其中,3’非编码区包含3个mRNA不稳定基序"ATTTA";该蛋白序列具有IL-10家族的典型序列特征;序列同源性比较表明,所获得的序列与GenBank上登录的鲤鱼IL-10基因同源性为89.1%。[结论]该试验为进一步研究IL-10在体内的表达方式、功能特点、调控机理及其在炎症反应和免疫应答中的作用机制奠定了基础。     

国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的检测及基因分析

用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出IHNV,同时对扩增出的IHNV的DNA片段进行了序列分析。结果表明,从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的IHNV与IHNV的标准株RB-1株在序列上都具有98.1%的同源性,推导出在氨基酸序列上分别具有97%和99%的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的IHNV与RB-1株在序列上都具有92.5%的同源性,推导出氨基酸序列有93%的同源性。系统发育树分析结果表明,从国内发病的养殖虹鳟中分离出的IHNV与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的IHNV在进化上关系较为密切。     

牙鲆kiss2基因的分子鉴定及表达分析

为克隆与牙鲆生殖相关的神经内分泌因子kiss2基因,并检测该基因在牙鲆成体不同组织及早期不同发育阶段的表达变化,本研究采用Trizol法提取牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段样品总RNA;参照其他物种的kiss2 c DNA序列,设计并合成kiss2引物进行PCR扩增;运用实时荧光定量PCR检测kiss2基因在牙鲆成鱼各组织及早期不同发育阶段的表达情况。结果成功地获得长度为449 bp的牙鲆kiss2 c DNA序列,其中编码区序列为366 bp,编码121个氨基酸。在该序列中发现了高度保守的"FNYNPLTLRF"序列,此序列可以调节促性腺激素释放激素和黄体生成素的合成与释放。定量PCR结果显示,牙鲆kiss2基因在脑组织中的表达量最高,在卵巢和精巢中也均有表达;牙鲆kiss2基因在胚胎阶段表达量相对较低,而在孵化后第7 d其表达量显著增高,且在孵化后的第29 d达到高峰。说明牙鲆kiss2基因具有明显的时期和组织差异性表达,其在牙鲆脑中的丰富表达及在精巢和卵巢中的表达表明该基因可能在牙鲆神经系统与生殖中发挥重要作用。     

虹鳟鱼肌肉营养成分的分析

采用国际所规定的方法，对虹鳟鱼肌肉的营养成分进行了测定，其粗蛋白为２０．５％，粗脂肪为３．３４％，水分为７３．６％；用氨基酸自动化分析仪测定了１８种氨基酸含量，并与青鱼、草鱼、兴国红鲤、链鱼、鳙鱼的营养含量进行对比分析，结果表明；虹鳟鱼的蛋白含量、脂肪含量以及必需氨基酸的含量均高地上述几种淡水鱼类。     

抗菌肽不同处理方式对虹鳟免疫指标的影响

为明确中国鲎基因工程抗菌肽不同处理方式对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)存活率的影响,分别在虹鳟仔鱼和成鱼两个阶段采用浸泡和混合饲料两种方式应用抗菌肽。采集仔鱼全鱼组织,成鱼血清及头肾组织,通过对SOD、ALP、CAT、IL-1β、IFN-γ、TNF-α等免疫相关酶水平及细胞因子表达量变化情况的检测,验证抗菌肽不同处理方式对虹鳟免疫指标的影响。结果发现:应用84 U/mL抗菌肽浸泡虹鳟仔鱼10次,浸泡后第4天,试验组免疫相关酶水平明显高于对照组,其中IL-1β、IFN-γ差异极显著(P<0.01),其他差异显著(P<0.05)。浸泡后第15天,试验组免疫相关酶水平仍高于对照组健康鱼,其中IL-1β、IFN-γ差异极显著(P<0.01),其他差异显著(P<0.05),但对照组发病鱼免疫相关酶水平与试验组相比显著下降,SOD、ALP、IL-1β、IFN-γ均差异极显著(P<0.01),其他差异显著(P<0.05)。试验结束统计仔鱼存活率,试验组存活率高达95.1%,对照组存活率仅为29.9%。成鱼期采用混合饲料和浸泡两种方式应用抗菌肽。结果显示,混合饲料的最适添加量为50 mg/kg饲料,浸泡最佳浓度为84 U/mL,最佳浸泡时间为3 min。研究表明,对不同处理方式进行对比,在仔鱼期进行浸泡对虹鳟免疫指标的影响最为显著。其可能与抗菌肽种类、作用方式及养殖虹鳟疾病暴发特点有关。本研究可以为虹鳟养殖过程中抗菌肽的应用方式提供依据。     

草鱼钙网蛋白的克隆与组织表达

钙网蛋白是一种高度保守的分子伴侣蛋白,作为内质网主要的钙结合蛋白,广泛存在于真核生物细胞中,在病毒、寄生虫感染以及温度、氧气胁迫等情况下对细胞起保护作用。本试验中采用RACE方法首次克隆获得草鱼Ctenopharyngodon idellus钙网蛋白cDNA全序列,其全长为1 389 bp,开放阅读框为1 263bp,编码为421个氨基酸。将获得的草鱼钙网蛋白编码氨基酸序列与其它物种分别进行同源性比较,发现草鱼与斑马鱼Danio rerio、虹鳟Oncorhynchus mykiss的同源性较高,分别为86.26%、76.78%,而与人Homo sapiens、小家鼠Mus musculus的同源性为69.67%、69.19%。通过半定量RT-PCR检测可知,钙网蛋白在草鱼的肌肉、肠道、皮肤、肝胰脏、肾脏、脾脏、鳃和鳍中均有表达,其中在肝胰脏、鳍条中的表达量最高,除与皮肤中的表达量无显著差异外（P〉0.05）,均显著高于其它5个器官组织（P〈0.05）。     

盐度驯化过程中虹鳟血清渗透压、激素水平及离子组成的变化

在0、8、16、24、32 5个盐度梯度下对虹鳟Oncorhynchus mykiss进行驯化,研究了盐度对虹鳟血清中3种激素含量、渗透压以及离子浓度的影响。结果表明：淡水中虹鳟的血清渗透压最低,但进入盐度为8、16的水体中时,其渗透压迅速升高,之后随着驯化时间的延长明显下降,盐度为24时其渗透压变化较小,盐度为32时其渗透压稍有下降并稳定在（327.0±2.7）mOsm/kg;随着盐度的升高,虹鳟血清中的皮质醇（COR）含量明显增加,在盐度为24时又开始下降;血清中三碘甲状腺原氨酸（T3）含量整体上随盐度的升高呈下降趋势,而四碘甲状腺原氨酸（T4）含量在盐度为16时最低,之后随盐度的升高而增加;随着盐度的提高,虹鳟血清中Na＋、Cl-浓度均呈现出明显上升趋势;血清中K＋浓度在盐度升至8时的第4 h出现急剧下降,之后在第96 h又有所回升,在盐度为24的第96 h上升到最高（3.76 mmol/L±0.05mmol/L）,在盐度为32的第4 h又下降至最低（1.14 mmol/L±0.15 mmol/L）;血清中Ca2＋浓度在盐度为0～16时的变化趋势与K＋相似,从盐度为24时开始显著上升,到盐度为32时的第96 h上升至最高值（3.39 mmol/L±0.01 mmol/L）;除盐度为32时的Ca2＋〉K＋之外,各盐度条件下虹鳟血清中Na＋、K＋、Cl-、Ca2＋4种离子浓度的高低顺序均为Na＋〉Cl-〉K＋〉Ca2＋。本研究结果表明：虹鳟在高渗环境下,能迅速启动海水中渗透压的调节机制,在皮质醇、T3、T4等几种激素共同作用下增强对高盐度的适应能力。     

鲤鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]分离、鉴定鲤鱼嗜水气单胞菌。[方法]从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子和16S rRNA基因序列的测定,研究分离菌的形态、生理生化特征及致病性。[结果]分离到的2株优势菌的菌落形态特征基本一致,经鉴定,确认为嗜水气单胞菌。无菌滤液试验表明,鲤鱼细菌性败血症不是由病毒引起的。腹腔注射分离菌菌悬液的鱼在7 d内全部死亡,人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又可分离到该菌株。分离提纯的致病菌株产生了β-溶血环,经蛋白酶试验为阳性。16S rRNA基因序列同源性分析发现同源性为98%。[结论]嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的致病菌。     

鲤鱼IL8的克隆及序列分析*

 利用DD-RTPCR（正常鲤鱼外周血白细胞和经有丝分裂源刺激后白细胞的总RNA）获得的差异显示片段B₁₀克隆（编码IL8的一段序列）,对该基因进行DIG标记,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×10⁴个重组噬菌体中,经过2轮筛选最终获得阳性克隆,挑选了3个分别命名为IL8-1,IL8-2,IL8-3。测序后经NCBI Blast分析表明,阳性克隆具有完整阅读框架,均为编码鲤鱼IL8的全长cDNA,编码的多肽由98个氨基酸残基组成,其相对分子质量理论推导值为 10 848.9 Da,等电点为8.68。且与2003年12月Dev Comp Immunol.杂志报道的荷兰鲤鱼氨基酸的同源性达84%。     

鲤鱼白细胞介素-1β全长cDNA的克隆·鉴定及其差异表达分析（摘要）（英文）

[目的]进行鲤鱼白细胞介素-1β（IL-1β）全长cDNA的克隆、鉴定及其差异表达分析。[方法]利用DD-RTPCR方法获得差异表达cDNA片段,对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行筛选,克隆了鲤鱼IL-1β的全长cDNA,并进行了序列分析和差异表达分析。[结果]获得的阳性克隆含有1个大小为831bp编码276个氨基酸的完整开放阅读框。聚类分析表明,鲤鱼IL-1β氨基酸序列与日本鲤鱼紧密聚为一支,氨基酸序列的同源性达95%,之后聚类顺序依次为鲫鱼、斑马鱼、猪、牛、马、人和小鼠。差异表达分析表明,经有丝分裂原刺激后前期（2h）白细胞中IL-1β的表达量显著增大,但随着时间推移（12,24h）并非一直较同期大,表达量总体趋势成峰形。[结论]为进一步研究IL-1β在体内的表达方式、功能特点和调控机理以及在炎症反应、应急反应和免疫应答的作用机制奠定了基础。     

基于MHC\|DAB基因内含子序列的3种虹鳟养殖群体遗传结构分析

虹鳟是当前全球性养殖品种,采用PCR\|SSCP的方法,分析了甘肃金鳟、道氏虹鳟和美国金鳟三个虹鳟养殖群体各30个个体MHC\|DAB基因第2内含子序列（308 bp）的遗传变异。108个阳性克隆经SSCP筛选及测序,共获得11种不同的核苷酸序列（Ⅰ~Ⅺ）,单个个体最多存在4种等位基因。等位基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ是三个群体共有的;Ⅳ仅存在于道氏虹鳟中;Ⅶ仅存在于甘肃金鳟中;Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ仅存在于美国金鳟中。甘肃金鳟、道氏虹鳟、美国金鳟群体内核苷酸多态位点分别为17个、19个、22个,核苷酸多样性指数（Pi）分别为0.005、0.008、0.013,平均核苷酸位点差异数（K）分别为1.200、2.000、3.333。甘肃金鳟群体与道氏虹鳟群体间的遗传距离最小(0.231),与美国金鳟群体间的遗传距离最大(0.539),三个群体间的遗传分化均达到了种群的分化标准（D＞0.05）。群体遗传分化系数GST为0.097,表明变异主要来源于群体内个体间。