油菜叶绿体多顺反子双交换表达载体的构建(英文)

[目的]构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,以期为油菜叶绿体基因工程研究奠定基础。[方法]根据GenBank中已知的油菜叶绿体DNA序列AF267640和Z50868,设计两对引物,用PCR方法获得了两段甘蓝型油菜叶绿体DNA片段,分别命名为RbcL和ACCD。将这两段甘蓝型油菜叶绿体DNA同源片段克隆到质粒pMD18-T中得到质粒pHBM715,然后再将由壮观霉素抗性基因aadA、甘露聚糖酶基因man和绿色荧光蛋白基因gfp这3个基因串联的表达盒克隆到质粒pHBM715中,从而构建成甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体pHBM716,并将该载体在大肠杆菌中进行表达鉴定。[结果]通过平板定性分析对所构建的油菜叶绿体表达载体上的表达盒进行了功能鉴定,表明同一多顺反子的3个基因在大肠杆菌中均得到了表达。[结论]该研究成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,为油菜叶绿体基因工程研究奠定了基础。     

含铁蛋白FAO1融合基因的衣藻核转化表达和分析

【目的】fao1编码Candida cloacae中一种含铁辅基的长链脂肪醇氧化酶。通过构建该基因的衣藻核转化表达载体进行转化,根据表达蛋白的生物活性判断fao1能否充分利用衣藻叶绿体中的铁元素行使功能;同时也为需铁固氮酶基因的研究提供方向。【方法】通过PCR把PsaD信号肽、fao1、His-tag标签融合,连接到pDBle载体上;采用玻璃珠转化法,将重组子导入莱茵衣藻（CW15）中;经博来霉素筛选后,获得转基因植株。运用PCR和RT-PCR法检测了转化衣藻,并且用亲和层析柱纯化蛋白,同时进行FAO1活性检测。【结果】重组质粒测序完全正确;PCR和RT-PCR检测转化衣藻基因组DNA和RNA,扩增片段与预期相符;转化衣藻FAO1蛋白纯化洗脱液使ABTS（2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐）底物反应变色。【结论】成功构建了信号肽、FAO1和His-tag融合基因的衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中,并成功转录,纯化的蛋白检测有活性。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

3-1E/mChIL-15融合基因构建及在真核细胞中的表达

将鸡堆形艾美尔球虫(E.acervulina)子孢子和裂殖子表面抗原3-1E基因片段与鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL15)通过四个柔性氨基酸SPGS连接,构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1/3-1E-linker-mChIL-15。表达质粒纯化后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光和免疫组织化学方法对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。结果表明,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后30h可检测到融合基因编码的融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达。研究为鸡艾美尔球虫基因工程疫苗进一步研制及应用奠定了基础。     

Bt基因转入烟草叶绿体获得转化植株的研究

构建了苏云金杆菌晶体毒蛋白基因Cry1Ab的烟草叶绿体表达载体pCTBt,该载体以烟草叶绿体基因组trnI-trnA为同源重组片段,含有壮观霉素抗性筛选标记基因aadA、质体特异性启动子Prrn和终止子TpsbA.利用基因枪转化法,将pCTBt导入栽培烟草红花大金元叶绿体,经过4次继代筛选,获得9个抗壮观霉素的转化株系,转化频率为0.3～0.6株/枪,其中有5个株系PCR检测结果为阳性,初步确定Cry1Ab基因已整合到烟草叶绿体中.转基因烟草抗斜纹夜蛾试验表明,幼虫死亡率为10%～75%,转基因烟草植株具有较好的杀虫活性.     

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

肿瘤坏死因子α单链抗体基因的优化及衣藻叶绿体表达载体的构建

通过在EMBL数据库中搜索鼠源TNF-α单链抗体基因同源性最高的人胚系抗体基因TNF-α-ScFv,进行人源化改造,并选择衣藻叶绿体偏爱的密码子对TNF-α-ScFv基因进行优化,随后构建带psbA启动子:TNF-α-ScFv::psbA 3′终止子表达框的中间载体,再将psbA启动子:TNF-α-ScFv::psbA 3′终止子表达框插入衣藻叶绿体表达载体p322中,通过PCR和酶切鉴定,确定已成功构建了TNF-α-ScFv基因的衣藻叶绿体表达载体。     

一步法构建莱茵衣藻叶绿体表达载体

为简化莱茵衣藻叶绿体表达载体构建步骤,将莱茵衣藻叶绿体中表达所需的DNA 元件组合,构建入可一步 TA 克隆插入靶基因的载体pTBNK,可直接用于在莱茵衣藻叶绿体表达靶基因。将EGFP 克隆至表达载体pTBNK,经 蓝白班筛选获得阳性转化子pTBNK-EGFP,通过基因枪转化衣藻叶绿体并获得阳性克隆。通过PCR 鉴定,EGFP 成 功整合至衣藻叶绿体基因组中。     

梭梭HaACT基因片段的克隆和3’UTR序列分析

【目的】以克隆HaACT基因为出发点,为进一步分析其表达特点奠定基础。【方法】根据NCBI上已发表的藜科其他植物肌动蛋白(Actin)序列的保守区设计一对简并性引物,以梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝为材料提取总RNA,采用RT-PCR法和3’RACE技术克隆了HaACT基因部分片段及3’UTR序列。【结果】得到HaACT基因片段1 107 bp,该序列编码257个氨基酸,3’UTR序列长度为416 bp。使用NCBI和DNAMAN软件对3’UTR序列进行了同源性分析。HaACT基因3’UTR序列与CaACT基因3’UTR序列的相似性高达93%,与BvACT基因3’UTR序列相似性为92%,与GhACT基因3’UTR序列相似性最低,为86%。【结论】HaACT基因与其他植物Actin基因可能具有相似的调控机制。     

莱茵衣藻MAPK4基因RNAi载体的构建及鉴定

[目的]构建莱茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi载体。[方法]提取莱茵衣藻细胞总RNA,利用PCR扩增出编码MAPK4的基因片段,用基因工程技术将MAPK4基因片段连接载体p MD18-T上,经过2次不同的双酶切后,与RNAi中间载体p T282连接,最后连接到干涉载体p Maa7IR/XIR上,用酶切及测序鉴定MAPK4基因RNAi载体并转化莱茵衣藻。[结果]经限制性内切酶酶切及测序鉴定,证实为重组质粒,并且该重组载体可在莱茵衣藻中表达。[结论]构建的MAPK4基因RNAi载体结构正确,为进一步利用RNAi技术使MAPK4基因沉默表达,研究MAPK4在莱茵衣藻中的生物学功能奠定了试验基础。     

MgSO_4和MnSO_4对切花菊保鲜效果的初步研究

以200 g/L蔗糖+50 mg/L柠檬酸+100 mg/L 8-羟基喹啉+1 mg/L 6-BA作为母液,分别与50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L 3个浓度的MgSO4和MnSO4.H2O混合后形成不同的切花菊保鲜剂配方。以母液作为处理Ⅶ,以母液+AgNO3作为处理Ⅷ,以蒸馏水作为对照(CK),对以上经保鲜剂处理的切花菊进行形态指标和生理指标的测定。结果表明:母液+50 mg/L MgSO4和处理Ⅷ2种保鲜剂对切花菊的保鲜效果显著,且二者效果相当,Mg2+可以在切花菊保鲜液中取代Ag+。     

番木瓜eIF4E和eIFiso4E酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

通过RT-PCR获得番木瓜eIF4E和eIFiso4E基因的编码区,将其分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-eIF4E,pBD-GAL4-eIFiso4E。测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。结果表明,获得了正确的番木瓜eIF4E,eIFiso4E基因编码区,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,在SD/-His-Trp营养缺陷平板上不能生长,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,这为下一步利用酵母双杂交系统检测番木瓜eIF4E,eIFiso4E蛋白与病毒的相互作用奠定了基础。     

天然沸石与几种改性沸石对NH4+吸附解吸特性的研究

采用室内分析的方法,研究天然沸石及改性沸石对NH4 的吸附解吸特性。结果表明,K-沸石、Ca-沸石、Mg-沸石和Ba-沸石对NH4 吸附量及解吸量均比天然沸石高,其中K-沸石最高,其它三者相近。H-沸石与天然沸石相比,在低浓度时比天然沸石的吸附(解吸)量高,但是在高浓度时吸附(解吸)量则降低。改性沸石与天然沸石相比,不仅提高了NH4 的吸附,同时还促进了NH4 的解吸,说明K-沸石、Ca-沸石、Mg-沸石和Ba-沸石,既具有较强的保氮能力,又具有较高的氮素供给能力,在生产实践中有着广阔的应用前景     

小麦抗白粉病基因Pm4的STS标记

根据与小麦抗白粉病基因Pm4a共分离的RFLP探针BCD1231的序列设计引物,以含小麦抗白粉病基因Pm4b的小麦近等基因系VPM/7*百农3217、抗病亲本VPM和轮回亲本百农3217为材料进行PCR扩增,结果在抗病池与VPM中扩增出一条约为410bp大小的特异带STS410,而在百农3217中无此特异PCR扩增带.进一步对144株VPM/7*百农3217的F2分离群体进行遗传连锁分析,估算出该PCR标记STS410与抗病基因Pm4b的遗传距离为3.0cM.用设计的这对STS-PCR引物对8个感病品种和17个含Pm基因的抗病亲本进行PCR扩增,结果发现:STS410只出现在含有Pm4基因的材料中.因此,PCR标记STS410可方便地用于小麦抗白粉病基因Pm4的分子标记辅助选择育种.     

离子束诱变对M_4代小麦醇溶蛋白和氨基酸组分的影响

对离子束诱变小麦M4代高蛋白稳定株系的醇溶蛋白和氨基酸组分进行了分析,结果表明:小麦高蛋白系和对照相比,在ω区醇溶蛋白谱带数目明显增多,而且从谱带上可以推测,M90株系间的遗传性、稳定性优于M91株系;高蛋白系氨基酸含量(以干重为基础)都有大幅的增长,尤其以谷氨酸和苯丙氨酸的增幅最大。     

转OsMAPK4基因水稻耐盐性分析

构建了由组成型启动子E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pCME12,利用农杆菌介导法转化黑龙江省主栽品种五优稻1号水稻愈伤组织,Southern杂交检测表明,OsMAPK4基因整合到水稻基因组上,获得了转基因水稻植株。对转基因水稻在种子发芽期和苗期进行了耐盐性分析,结果表明,转基因水稻种子在含0.2mol·L-1NaCl的培养基上能正常萌发;转基因水稻幼苗在0.4mol·L-1NaCl处理时茎部仍然为绿色,种子萌发与幼苗生长情况略优于非转基因植株栽至无盐土壤中,植株能萌发出新叶片。     

哺乳动物BMP4基因A型启动子的比较分析

以鸭嘴兽BMP4基因组序列为模型,采用比较基因组学方法分析哺乳动物BMP4基因A型启动子的结构特点。该研究分离出一段长112bp的进化上高度保守的核心启动子序列以及多个转录因子结合位点和CpG岛结构,并且在BMP4核心启动子区域发现了2种具有重要生物学功能的回文结构,为进一步研究该型启动子的转录调控功能提供了理论基础。同时以鸭嘴兽基因组为参照模型,也为今后研究其他哺乳动物进化上保留下来的基因提供更多新信息。     

不同处理方法对假苍耳种子萌发的影响

利用物理和化学方法系统地研究了硫酸、热水、FeSO4溶液、低温、赤霉素等不同处理对假苍耳种子萌发的影响。结果表明,不同的处理对假苍耳种子的萌发作用具有明显的差异。处理20s的硫酸,60℃热水,0.20%FeSO4溶液和500mg·L-1的赤霉素分别提高了假苍耳种子10%、17%、5%、11%的发芽率。低温处理不能提高种子发芽率。研究假苍耳的萌发作用对明确假苍耳发生危害具有重要作用,对控制假苍耳的蔓延具有重要的指导意义。     

小鼠Oct4基因的克隆及其原核表达载体的构建

Oct4是POU区转录因子家族中的一员,在未分化胚胎癌和胚胎干细胞中表达.对细胞未分化状态的维持发挥重要作用。本文通过RT-PCR方法克隆得到小鼠Oct4基因,并成功构建其原核表达载体pET-15b-Oct4,为今后对其功能及生物学活性的进一步研究奠定了基础。     

水稻MAPK基因OsMPK4的克隆鉴定、蛋白表达和转基因载体构建

克隆鉴定了一个水稻促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)基因OsMPK4.OsMPK4基因cDNA全长1483 bp,包含一个1131 bp的开放阅读框,编码一个由376个氨基酸组成的蛋白,预测分子量为42.8 kD.OsMPK4基因位于水稻第10号染色体上,由6个外显子和5个内含子组成.OsMPK4蛋白具有MAPK的11个保守结构域及磷酸化位点TEY模体.系统进化树分析表明,OsMPK4属于B组MAPK成员,与已知水稻MAPK蛋白有56%～74%的一致性.原核表达了OsMPK4基因,纯化获得重组OsMPK4融合蛋白,并构建OsMPK4的转基因双元载体,用于OsMPK4的生化功能及其生物学功能研究.