抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化

【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显著提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.     

土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆及其功能验证

【目的】从土壤宏基因组中克隆新的抗草甘膦新基因,并对其功能进行验证,为培育抗除草剂转基因新品种奠定基础。【方法】利用被草甘膦污染的土壤建立宏基因组文库,经筛选从中成功克隆了一个新的具有草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因(命名为soilA)。构建了Prrn启动子驱动soilA基因的原核表达载体pSYTH-soilA,将其导入大肠杆菌进行原核草甘膦抗性试验,构建了35S启动子驱动soilA基因的植物表达载体pC330E,利用农杆菌介导法转化烟草,并对经PCR和胶体金试纸条鉴定的转基因烟草植株进行草甘膦耐受能力检测。【结果】序列分析表明,所获得的soilA基因长1 347bp,编码448个氨基酸,经BLAST分析,结果表明其属于ClassⅡ型EPSPS基因家族。原核表达soilA可使受体菌具有耐受1 200mmol/L草甘膦。构建soilA植物表达载体pC330E,通过农杆菌介导法将其导入烟草,经PCR和胶体金试纸条检测共获得107株阳性烟草植株,经过喷洒试验获得了3株高耐受草甘膦植株,这3株转基因烟草最高可耐受200mmol/L草甘膦。【结论】新克隆的编码EPSPS的soilA基因能够提高受体材料的草甘膦耐受能力。     

转phyA2、ZmTMT和Bar玉米的获得及其特性分析

【目的】玉米是家禽和单胃动物饲料的主要原料,但玉米籽粒中高活性的α-生育酚含量较低,且籽粒中的磷主要是以植酸磷的形式存在,动物不能有效吸收利用,因此,饲料中需要添加化学合成的维生素E和无机磷或微生物来源的植酸酶以满足动物生长发育的需要,增加了饲料成本,同时又容易造成磷污染。通过转基因获得α-生育酚含量和植酸酶活性大量提高的玉米,为饲用玉米育种提供材料基础。【方法】构建含有3个基因表达盒的载体,采用农杆菌侵染的方法转化玉米,草铵膦作为筛选压力;通过喷施草铵膦和PCR鉴定的方法筛选转基因阳性植株,RT-PCR分析目的基因在转录水平的表达情况;Western blot分析目的基因在翻译水平上的表达情况,采用分光光度计测定转基因玉米籽粒中的植酸酶活性,利用HPLC测定籽粒中的维生素E含量,同时比较转基因株系与野生型在其他营养成分和农艺性状上的差异。【结果】构建了胚乳特异性启动子123387驱动的植酸酶基因phyA2表达盒、胚特异性启动子13387驱动的玉米γ-生育酚甲基转移酶基因ZmTMT表达盒以及组成型启动子CaMV 35S驱动的草铵膦抗性基因Bar表达盒串联的植物表达载体;转化玉米获得转基因植株;喷施草铵膦和PCR鉴定得到阳性植株;经过多个世代回交转育,获得目标性状均较好的2个转基因纯合玉米株系TPB1和TPB2;RT-PCR和Western blot分析结果表明phyA2、ZmTMT和Bar在转基因玉米中显著高表达。植酸酶活性测定结果表明,转基因玉米籽粒中植酸酶活性达到10 000—13 000 U·kg^-1。维生素E含量测定结果表明,转基因玉米籽粒中90%以上的γ-生育酚转化为α-生育酚,α-生育酚的含量达到50—70 mg·kg^-1,α-三烯生育酚的含量也有明显增加。转基因玉米中的植酸酶活性和α-生育酚含量完全能够满足动物饲料的需要。转基因株系的农艺性状与野生型无显著差异,TPB1的营养成分与野生型总体无显著差异,TPB2稍高于野生型但是未产生不利影响;且均具有草铵膦抗性。【结论】获得的富含维生素E和植酸酶、且具有除草剂抗性的玉米新材料可以用于玉米杂交种的开发应用,降低饲料成本,提高磷的利用率,减少环境污染。     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。     

抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

多启动子驱动苘麻epsps优化基因植物表达载体的构建及其转化

转基因抗草甘膦作物是商业化最广泛的转基因作物之一,但是棉花的雄蕊对草甘膦敏感,在四叶期后喷施草甘膦会造成抗草甘膦棉花雄性败育,不能正常授粉,最终导致产量降低。为降低草甘膦对棉花育性的不良影响,有针对性的构建了棉花生殖器官优势表达的arf1启动子、棉花草甘膦高效诱导表达的ag2启动子和组成型启动子CaMV35S驱动苘麻epsps优化基因的串联三表达盒植物表达载体,采用农杆菌喷花法将其转入棉花,对T0代喷施草甘膦筛选获得8株对草甘膦有较强抗性并且生殖发育正常的植株;PCR和RT PCR分析表明外源基因已整合至棉花基因组并正确表达。为探索用不同类型启动子驱动相同基因以扩大外源基因在植物中的表达范围和培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因棉花打下基础。     

薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析

 【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。     

百合花药和雌蕊特异启动子功能分析

【目的】从"索邦"百合(Lilium orential"Sorbonne")中克隆查尔酮合成酶基因启动子相似序列PCHS2,并对其进行表达模式分析。【方法】从"索邦"百合中PCR扩增PCHS2启动子序列,与GUS报告基因融合,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana var.Columbia)和矮牵牛(Petuniahybrida "Dreams Midnight"),抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,GUS组织化学检测分析启动子在转基因植株中的表达模式。【结果】转基因拟南芥和矮牵牛的抗性筛选和PCR检测结果显示,成功地获得了转基因阳性植株。GUS活性分析表明,在PCHS2的驱动下,仅能在花药和雌蕊中检测到GUS活性,茎、叶和其他花组织中都没有发现GUS活性的表达。【结论】PCHS2启动子具有花药专一性。     

在质体中表达EPSPS赋予烟草草甘膦抗性

在烟草质体中应用来源于玉米的复合型顺式表达元件驱动来源于Isoptericola variabilis的新型耐草甘膦EPSPS基因AroA_(I.va*)的表达,使其在叶片及非绿色组织中同时高效表达。对获得的同质化质体转化植株进行转录及蛋白水平分子检测,结果表明:AroA_(I.va*)基因在转基因植株叶片及根部组织中均得到有效表达;达到同质化的烟草转基因植株pLSZ3#2和pLSZ3#3的T_0代种子可耐受高于12 mmol/L(2 000 mg/L)的草甘膦处理,在温室中培养的转基因植株可耐受1 800 mg/L剂量的草甘膦喷施处理。野生型与转基因植株的正反交实验证实通过质体转化获得的草甘膦抗性转基因植株具有母性遗传的特点。