白桦cDNA-AFLP体系的优化和建立

为了建立适合白桦的cDNA-AFLP体系,对反应体系中的酶切、预扩增、选择性扩增的引物筛选等几个重要的影响因素进行优化,得到了适合白桦的cDNA-AFLP反应体系。选择白桦雄花为研究材料,用改良的CTAB法提取总RNA,采用低频酶EcoRⅠ和高频酶MseⅠ酶切双链cDNA。通过研究发现,预扩增中Mg2+浓度为2mmol/L,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.25mmol/L,Taq酶浓度为1U,退火温度控制在60℃时,预扩增结果较好。另外,从16对引物组合中选出11对选择性较好的引物组合,扩增的产物经过6%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳和银染检测,得到清晰、分辨率高、信号强度明显且重复性好的结果,表明该cDNA-AFLP分析体系适用于白桦相关的功能基因的研究。     

基于桃花瓣的cDNA-AFLP分析体系的建立

以桃为材料,研究了影响cDNA-AFLP反应体系的几个关键因素,建立了适宜桃的cDNA-AFLP分析体系,得到了较为清晰可辨的cDNA-AFLP指纹图谱。结果表明,改良CTAB法提取的RNA较完整,纯度较高;反转录试剂盒形成的双链cDNA经EcoRⅠ和MseⅠ完全酶切后,16℃连接过夜;20μL的体系中,连接产物2.0μL作为预扩增的模板,循环数为30,预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板,扩增结果较好。     

马铃薯EcoRⅠ/MseⅠ内切酶组合AFLP反应体系的优化与引物筛选

以2个马铃薯品种为材料,对AFLP反应过程中的关键因素(DNA浓度、酶切体系、扩增体系等)进行了优化,旨在建立适合马铃薯的EcoRⅠ/MseⅠ内切酶组合的AFLP反应体系和筛选扩增条带丰富的引物。结果发现,优化的马铃薯AFLP反应体系为37℃酶切4 h,37℃连接4 h,连接产物稀释10倍用于预扩增,预扩增产物稀释30倍用于选择性扩增。利用建立的优化反应体系,以10个甘肃省主栽马铃薯品种为材料,从256对引物组合中筛选出24对扩增条带多、条带清晰、多态性好的引物组合。     

菜心cDNA-AFLP分析体系的优化与建立

以菜心的顶端分生组织为试材,对影响菜心cDNA-AFLP体系的关键因子进行了探讨,以期建立适于菜心转录组差异表达的cDNA-AFLP分析体系。结果表明:Trizol法适用于菜心总RNA提取;SMART双链cDNA合成法效率较高,其中第二链cDNA合成的最佳循环数为24个;Taq I/Ase I分步各酶切3 h可使双链cDNA酶切完全;预扩增体系以模板稀释20倍,27个循环扩增效果较好,退火温度对扩增结果影响不大,但Mg2+对PCR扩增影响较大,经比较加入2.5μL Mg2+(25 mmoL/L)的预扩及选扩电泳的效果均最佳;预扩产物稀释20倍用于选择性扩增,其PAGE电泳可以获得丰富且重复性好的带型。cDNA-AFLP分析体系的优化与建立为菜心抽薹开花分子机理进一步研究奠定了基础。     

4种扇贝AFLP分析体系的建立

构建了4种扇贝扩增片段长度多态性(AFLP)的分析体系,对DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等条件进行了优化。结果表明:用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切,核心序列加3个选择性碱基的选择性扩增引物,E32-M49和E32-M62两个引物组合,以及20μL选择性扩增体积,可得到十分稳定的结果。所得产物经电泳和银染后可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为AFLP技术在扇贝相关研究中的应用提供了依据。     

枣选择性扩增微卫星体系的建立及优化

【目的】建立和优化枣的选择性扩增微卫星（SAM）技术体系,丰富枣群体遗传学研究的方法,同时为枣利用SAM法开发SSR引物提供技术参考和模板。【方法】以冬枣、大荔龙枣和金丝小枣为试材,采用CTAB法提取样品DNA,对SAM试验过程中的酶切-连接、抑制性扩增、预扩增、选择性扩增等关键因子进行研究。【结果】利用PstⅠ和MseⅠ双酶切系统,分步法进行酶切-连接是后续试验成功的关键,抑制性扩增（20.0μL体系）模板取酶切连接液2.0μL,预扩增和选择性扩增（20.0μL体系）的模板分别取上步扩增的稀释产物各2.0μL;抑制性扩增和预扩增反应中,ExTaq取0.5 U,反应25个循环,产物稀释20倍进行下一步扩增;选择性扩增采用前6个循环中退火温度梯度降低（每循环降低1℃）的反应程序,体系中可将ExTaq用量增加到1.0 U以保证酶的保真效果。【结论】试验利用优化后的反应体系,选用16个MseⅠadapter+NN primer和SSR primer（PCT6）组成引物对进行筛选,获得了谱带清晰、分辨率高、多态性丰富的电泳图谱。该研究结果为利用SAM技术开展枣的亲缘演化、遗传多样性分析及SSR引物开发等方面的研究打下了基础。     

华北落叶松AFLP反应体系的建立和优化

[目的]建立和优化华北落叶松（Larixprincipis-rupprechtii Mayr.）的AFLP反应体系。[方法]以华北落叶松为材料,对其AFLP分析过程中的5个主要影响因素（酶切时间、内切酶用量、DNA模板用量、连接产物和预扩增产物稀释倍数）进行了研究。[结果]确立了适于华北落叶松AFLP分析的最佳反应体系,即在反应体积均为20.0μl的前提下,酶切时间为7 h（37℃3.5 h;65℃3.5 h）,EcoRⅠ和MseⅠ内切酶用量均为1 U,DNA模板用量为3.0μl（50 ng/μl）,连接产物稀释10倍取5.0μl用于预扩增,预扩增产物稀释70倍取4.0μl用于选择性扩增。[结论]采用该体系得到的电泳条带清晰可辨、多态性好、重复性强,可用于对华北落叶松遗传多样性和分子进化特征的深入研究。     

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

栓皮栎AFLP反应体系的建立

以栓皮栎叶片为材料,研究了AFLP反应体系中酶切-连接反应的方法与时间、预扩增反应和选择性扩增反应等几个关键因素。建立一套适于栓皮栎基因组的AFLP反应体系:基因组DNA的提取宜采用改良的CTAB法;酶切-连接反应体系采用一步法,其中DNA模板用量为200ng,酶切-连接反应4h;酶切-连接产物用于预扩增反应的最佳稀释倍数为20倍;预扩增产物不需要进行稀释直接用作选择性扩增反应。对各环节的效果检测与引物筛选验证表明该体系适合栓皮栎的AFLP分析。     

砀山酥梨AFLP技术体系建立及变异检测

通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于砀山酥梨AFLP分析的技术体系:酶切体系25 μL,总体积中含纯化后的DNA 500 ng;EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ各5 U,分步进行酶切;酶切完成后加入连接液,16℃连接过夜(8～12 h);连接产物稀释10倍用于预扩增;预扩增产物稀释15倍用于选择性扩增.应用确立的AFLP技术体系,对砀山酥梨的营养系变异类型进行了检测.结果表明,与砀山酥梨相比,8个营养系变异类型均出现了特异带,说明这些变异类型在遗传物质上发生了改变,属于芽变而不是彷徨变异.     

沙冬青cDNA-AFLP体系的建立及引物筛选

[目的]建立适合于沙冬青cDNA—AFLP的反应体系。[方法]以对照、3种逆境处理的沙冬青为材料,采用Trizol法和改良CTAB法提取总RNA。[结果]改良的CTAB法可抽提到较高质量的总RNA,适于沙冬青总RNA的提取。采用EcoRI/MseI酶切体系,64对选择性扩增引物中有35对适合沙冬青cDNA-AFLP分析。[结论]该研究为利用cDNA-AFLP标记对沙冬青抗逆基因进行深入研究奠定基础。     

番鸭cDNA-AFLP体系的建立

以番鸭脑垂体为材料,用Trizol法提取总RNA,用Superscipt Ⅱ-RT合成第一链cDNA,RNase H和DNA Polymerase合成第二链cDNA,最后用EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ分步酶切cDNA各2h,经T4连接酶合成双链cDNA,预扩增反应后产物稀释40倍进行选择性扩增反应.经1％琼脂糖电泳及6％变...     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

1材料与方法 1．1菌株供试拮抗链霉菌共10个菌株,均由该课题组分离自京郊菜田土壤和天然次生林土壤（表1）。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the preparation method and amplification system of antagonistic streptomyces DNA templates based on AFLP assays, and also provide a basis for the application of AFLP technology in the analysis of streptomyces or even actinomyces. [Method] The DNAs were extracted by the modified CTAB method and amplified by the Pst Ⅰ/Mse Ⅰ AFLP kit and its reaction system. The amplified products were analyzed by the denatured polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The genomic DNAs of ten antagonistic strains of Streptomyces were extracted and tested. The result of 0.8% agarose gel electrophoresis showed that the major DNA bands were clear without degradation and RNA residue, with the fragment sizes ranging from 37.64 to 40.86 Kb. By ultraviolet spectrophotometry, the OD260/OD280 values varying from 1.625 to 1.833 were obtained. Furthermore, the agarose gel electrophoresis of DNA products digested by Pst Ⅰ/Mse Ⅰ presented the dispersed fluorescent long band, which indicated that the enzymatic hydrolysis was fully carried out. The amplified bands of DNA templates by the screened three pairs of primers were clear with rich polymorphism. [Conclusion] The preparation method and amplification system of DNA template established in this study can be used in the AFLP analysis of Streptomyces.     

红麻叶绿体DNA非编码区扩增及PCR-RFLP多态性分析

为研究红麻叶片叶绿体DNA(cpDNA)非编码区的序列特征,采用改良CTAB方法提取红麻总DNA,以8份红麻光钝感突变体及其4份近缘种基因组DNA为模板,应用8对植物cpDNA通用引物对红麻cpDNA非编码区序列进行PCR扩增,优化cpDNA非编码序列PCR的扩增条件,应用4种限制性内切酶(EcoRⅠ、HindⅢ、TaqⅠ、AulⅠ)酶切扩增片段.结果表明:所筛选的通用引物适用于红麻cpDNA非编码序列扩增,扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测,片段大小为400-2000 bp,共扩增cpDNA片段大小约13000 bp.将PCR扩增产物进行酶切,每个片段均有相同的酶切位点,只有cp4引物对cpDNA的扩增产物经AluⅠ酶切获得多态性片段,红麻光钝感突变体及其对照的cpDNA存在部分变异,该结果可为进一步探讨红麻叶绿体基因组种内的变异情况提供理论依据.     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系,为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA,利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增,采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰,片段大小为37.64-40.86Kb,无降解现象,亦无RNA残留;其OD260/OD280为1.625-1.833;Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带,说明酶解充分;筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰,多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。     

胡杨杂交育种试验初报

[目的]研究胡杨与青杨派和黑杨派、白杨派杂交的难易程度,获得具有胡杨遗传特性的杂交品种.[方法]以胡杨为母本与青杨派和黑杨派、白杨派的杨树的杂交,采用树上套袋立木授粉法,以胡杨作为父本与青杨派和黑杨派、白杨派的杨树的杂交,采用切枝水培法.杂种苗的培育采用了营养杯育苗法.[结果]获得以胡杨为母本杂交种苗组合4个,以胡杨为父本杂交种苗组合3个.[结论]以胡杨为父本和母本的各杂交组合亲和力的顺序是:密叶杨×胡杨最强,青杨派和黑杨派间杂交种次之,白杨派最差,为以后胡杨改良打下了坚实的基础.     

胡杨膜系统的盐稳定性及盐胁迫下的代谢调节

比较胡杨和群众杨在盐分胁迫下的生化反应发现：（１）胡杨的细胞膜系统能忍耐２００ｍＭ ＮａＣｌ的高盐处理,其膜透性在高盐处理３ｄ没有显著增加,而群众杨的膜透性随盐分浓度的升高而升高。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的cDNA-AFLP分析

 【目的】分析经叶锈菌诱导小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的基因表达情况,寻找与抗病基因表达相关的片段。【方法】应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究TcLr38和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-22-65（THTS）互作时基因表达的差异。【结果】76对引物组合检测到约3 800条条带,平均每一对选择性引物可以获得50条条带,其中28对能够在小麦近等基因系TcLr38和感病对照Thatcher之间扩增出特异性条带。多态性条带划分为8种类型,其中3种类型可能与抗病基因相关。最终得到95条小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的特异性表达的转录衍生片段（TDF）,其中19条差异TDFs只在接种叶锈菌的TcLr38中出现,为上调表达,而8条差异TDFs为下调表达。对可能与抗病相关的特异TDFs中的21条片段进行序列测定与分析,经BLASTx比较,17个TDFs所推导的蛋白质序列在数据库中找到其所对应的同源序列,15个TDFs为已知功能的基因。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测决定蛋白激酶C、ATP结合蛋白、类受体激酶、信号传导组氨酸激酶（HPK）、肽酶家族M23、Dnak抑制蛋白DksA、甲硫氨酸tRNA合成酶、RanGTP酶激活蛋白1、烯酰辅酶A水合酶的TDFs可能与抗病或防御过程相关。     

广藿香~(60)Co-γ诱变体植株遗传多样性的ISSR分析

从广藿香的同一大田植株上取外植体构建了一批无菌材料。将这批无菌材料分别经过0,45,60,75,90 Gy的~(60)Co-γ射线辐照诱变处理,获得了172份Co-γ射线诱变体材料和1份对照无菌材料(CK;0 Gy)。分别提取这173份无菌材料的基因组DNA,用14条ISSR有效引物对173份种质材料的基因组DNA进行PCR扩增,共获得297条扩增产物,其中多态性条带为68条,诱变材料的多态位点比率PPB为43.13%,观测等位基因数Na=1.431 3,有效等位基因数Ne=1.257 3,Nei's基因多样性H=0.146 5,Shannon信息指数I=0.217 5。173份供试材料之间遗传关系系统树由UPGMA法,根据所得遗传相似系数矩阵构建。系统树图表明,当GS(遗传相似系数)值取0.09GS0.42时,可以把供试的173份材料划分为2个类群:即Ⅰ类群和对照(CK);当GS=0.44时,可把Ⅰ类群分为2个亚类群,即Ⅱ类群和90 Gy-43号材料;当GS值取0.46GS0.48时,又可把Ⅱ类群分为2支,即Ⅲ类群和75 Gy-13号材料。虽然有部分不同辐射剂量处理的诱变植株聚类在一起,但是总体上是,相同辐射剂量处理组的诱变植株聚为一类。结果表明,广藿香无菌材料经用~(60)Co-γ射线辐照诱变后发生变异频率较大,为此,~(60)Co-γ射线辐照诱变可作为广藿香种质创新的一种有效手段。