光质对龙眼胚性愈伤组织柯里拉京含量的影响

通过超声波提取‘红核子'龙眼胚性愈伤组织中的柯里拉京[β-1-O-galloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucose],并优化色谱分离条件,采用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)测定其含量,探讨培养天数及光质对龙眼胚性愈伤组织柯里拉京含量的影响。结果表明,龙眼胚性愈伤组织黑暗培养25 d柯里拉京含量最高;不同光质处理下柯里拉京含量依次为:黑暗(18.81 mg·g-1)红光(16.99 mg·g-1)绿光(16.89 mg·g-1)白光(15.10 mg·g-1)蓝光(12.52 mg·g-1),黑暗条件最有利于其合成,而蓝光则抑制其合成。     

CD20片段抗体在红花悬浮细胞中的表达研究

【目的】研究用红花愈伤组织建立红花悬浮细胞培养体系的条件,并利用红花悬浮细胞通过农杆菌介导转化法表达CD20复合片段抗体。【方法】以红花子叶为外植体,研究不同种类激素组合对愈伤诱导率的影响,筛选优质愈伤组织进行悬浮培养,探索不同初始接种量、蔗糖质量分数、水解酪蛋白质量浓度对红花悬浮细胞生长的影响。将CD20复合片段抗体基因两端引入XmaⅠ/EcoRⅠ酶切位点,并将其与pEASY-T1和pBasta载体相连,构建pEASY-T1-CD20克隆载体和pBasta-CD20表达载体,再将构建的pBasta-CD20表达载体转入根瘤农杆菌,利用根瘤农杆菌介导红花悬浮细胞转化法表达CD20复合片段抗体。【结果】红花子叶愈伤诱导最佳条件为MS+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L、温度(25±0.1)℃、光照70μmol/(m2·s)连续光照,继代培养条件为MS+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L、30μmol/(m2·s)连续光照、温度(25±0.1)℃。悬浮细胞体系培养最佳条件为不加琼脂粉的MS+NAA 1mg/L+6-BA 0.5mg/L、接种量2.5g(50mL培养基)、蔗糖质量分数2%、水解酪蛋白800mg/L。pBastaCD20表达载体构建成功,且目的蛋白在红花悬浮细胞中成功表达。【结论】成功构建了红花悬浮细胞培养体系,并用该体系成功表达了CD20复合片段抗体。     

油松胚性愈伤组织培养中褐化因素研究及增殖培养基的优化

【目的】调查油松Pinus tabulaeformis胚性愈伤组织增殖培养阶段不同因素对于褐化产生的影响,并结合增殖率对培养基进行调整优化以降低褐化率,提高利用率。【方法】以3个年份的9个细胞系的油松胚性愈伤组织为材料,利用单因素试验设计对放置不同数量愈伤块、pH、植物凝胶含量、糖种类和含量以及培养时间的褐化率和增殖率进行测定计算。采用正交试验选出最佳培养条件。【结果】单因素试验结果表明,褐化率在不同基因型间差异显著,且与增殖继代年龄显著正相关;在培养皿中放置6~7块愈伤组织、pH 5.8~6.0、培养基中添加2.0~3.0 g·L~(-1)植物凝胶、添加10 g·L~(-1)蔗糖能保证较低的褐化率和较高的增殖率,且蔗糖优于葡萄糖和麦芽糖。【结论】结合正交设计,90 mm培养皿中放置7块愈伤组织,培养基中添加2.5 g·L~(-1)植物凝胶、10 g·L~(-1)蔗糖,调节pH为5.9时,褐化率、增殖率和利用率最理想。     

微量元素对大花金挖耳悬浮细胞生长与黄酮含量的影响及其化感作用

【目的】筛选微量元素对大花金挖耳细胞培养胞内活性物质的浓度条件,为大花金挖耳大规模细胞培养活性物质开发利用提供依据。【方法】以大花金挖耳悬浮培养细胞为材料,研究Zn~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、I~-、BO■、MoO■等8种微量元素对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮类化合物累积的影响;并采用微量活性测定法测定细胞培养物的化感潜力。继代培养基为NT+1.0 mg·L~(-1) NAA+0.2 mg·L~(-1) BA。【结果】随培养基中Zn~(2+)、Co~(2+)、MoO■、Cu~(2+)、BO■等各处理微量元素浓度增加,大花金挖耳悬浮培养细胞生长量和黄酮含量呈先增后降趋势。MoO■、Zn~(2+)浓度为3.0μmol·L~(-1)、0.06 mmol·L~(-1)时,黄酮含量分别高达1.53%、1.46%,是对照的1.25、1.20倍;Cu~(2+)、BO■、Co~(2+)浓度分别为0.4μmol·L~(-1)、0.4 mmol·L~(-1)、0.2μmol·L~(-1)时,黄酮含量均高达1.35%,是对照的1.11倍;Mn~(2+)浓度0.1～0.8 mmol·L~(-1)时,黄酮含量逐渐降低,从1.22%下降到0.43%;I~-浓度在5～20μmol·L~(-1)范围内时,黄酮含量变化不大;0.1 mmol·L~(-1) Fe~(2+)浓度最适于细胞生长和黄酮合成;试验中,添加Zn~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、I~-、BO■、MoO■等8种微量元素可分别使细胞总黄酮产量达到382.00、291.28、327.34、337.82、288.89、293.90、333.76、379.00 mg·L~(-1),微量元素提高细胞总黄酮产量大小顺序依次是:Zn~(2+)MoO■Cu~(2+)BO■Co~(2+)I~-Mn~(2+)Fe~(2+)。大花金挖耳悬浮培养细胞的粗提物对供试的苘麻Abutilon theophrasti、鬼针草Bidens pilosa、黄瓜Cucumis sativus和黄豆Glycine max等4种植物幼苗根生长均具有抑制作用,毒力依次为19.86、14.69、19.03、59.07 mg·L~(-1)。【结论】在培养基中适量添加微量元素有利于大花金挖耳细胞的生长和黄酮的生物合成,但过高浓度的微量元素会导致黄酮生物合成能力下降;大花金挖耳悬浮细胞的胞内代谢产物对4种受体植物具有不同程度的化感作用。     

老瓜头悬浮细胞培养及基质消耗规律的初探

[目的]为老瓜头资源利用提供前期的生物技术试验参考。[方法]以老瓜头愈伤组织为外植体,运用正交设计试验,进行细胞悬浮培养,对接种量及悬浮培养基进行筛选试验研究,并测定了老瓜头细胞悬浮培养过程中硝酸盐、氨盐、磷酸盐、蔗糖及可溶性总糖含量的消耗。[结果]老瓜头愈伤细胞最佳液体培养基为不添加任何激素的MS培养基;其最适接种量为40 g/L;黑暗培养条件适合其细胞生长,其生长周期较短,生物量大;在老瓜头细胞培养初期(0~9 d),培养中的硝酸盐、氨盐、磷酸盐、蔗糖含量均呈急剧下降趋势,分别为初始含量的7.19%、21.53%、0.28%、1.53%,之后各自变化趋于平缓。[结论]初步建立了老瓜头悬浮细胞培养技术体系。     

药用植物青天葵的悬浮培养条件优化

以悬浮细胞干重增加率、酶活力为考察指标,研究不同培养基、光照条件、蔗糖浓度、培养基pH值对药用植物青天葵细胞生长的影响,对青天葵悬浮细胞培养方法进行条件优化。结果表明,1/4MS和1/2MS培养物外观形态最佳,1/2MS组培养物干重增加率最大,MDA含量最低,POD含量最高;暗培养条件有利于愈伤组织干重的增加;蔗糖浓度为1%时愈伤组织干重增加率显著高于其他处理组,pH6.0为青天葵悬浮培养的合适pH值,培养基中添加MES可明显提高干重增加率。     

龙眼体胚成熟过程中淀粉含量的变化

研究了光照条件、蔗糖含量、聚乙二醇(PEG6000)、脱落酸(ABA)及椰乳等因素对龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化的影响.结果表明:在光照低糖(质量分数为2%,下同)、光照高糖(质量分数为5%,下同)、黑暗低糖加PEG6000的作用下,龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化相似,整个成熟过程中呈单峰型;在黑暗低糖、黑暗低糖加ABA、黑暗高糖加ABA、黑暗高糖加椰乳作用下,龙眼体胚成熟过程中淀粉含量变化呈双峰型.在黑暗和高糖作用下且经历正常成熟的体胚中淀粉含量变化也很相似,总趋势都是上升的.     

沙地云杉胚性细胞悬浮培养研究

通过本次试验,得到了沙地云杉胚性细胞悬浮培养的最佳培养条件,即DCR+0.1mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+30g/L蔗糖,pH6.0,接种量3.0%(以鲜重计),摇床转速为110r/min,25±1℃,黑暗条件下震荡培养;研究了细胞生长鲜重、干重和pH值、细胞活力以及培养液中NO3-、NH4+、PO43-和总糖的消耗动力学变化.为今后进行沙地云杉的原生质体培养分离、基因导入及细胞融合等研究提供实验基础.     

曼地亚红豆杉细胞悬浮培养体系的建立

【目的】建立曼地亚红豆杉的愈伤组织细胞悬浮培养体系,为紫杉醇生产提供参考。【方法】以曼地亚红豆杉幼茎诱导的愈伤组织为材料,以B5培养基为基本培养基,利用单因素试验或正交试验,研究愈伤组织接种量、蔗糖质量浓度、激素类型及配比和防褐化试剂对曼地亚红豆杉细胞生长的影响。【结果】曼地亚红豆杉细胞悬浮培养的最佳培养基和培养条件为:B5+2,4-D 0.6mg/L+NAA 0.8mg/L+KT 1.0mg/L+柠檬酸220mg/L+PVP350mg/L+水解乳蛋白450mg/L+蔗糖30g/L(pH=5.8),接种量0.1g/mL,在培养箱中110r/min、25℃暗培养。【结论】曼地亚红豆杉愈伤组织细胞在所建立的培养体系中经过多次继代后,生长状况良好,表明该细胞悬浮体系比较稳定,可以用于大规模培养红豆杉细胞。     

玉竹愈伤组织诱导及其细胞悬浮培养体系的建立

以玉竹叶片和根状茎为外植体,研究植物生长调节剂、碳源和pH对玉竹愈伤组织诱导的影响以及植物生长调节剂对愈伤组织增殖的影响,通过正交试验初步建立并优化玉竹愈伤细胞的悬浮培养体系。结果表明,叶片和根状茎愈伤组织诱导的最佳培养基均为MS+1.0mg·L~(-1)?6-BA+0.5mg·L~(-1)?NAA+30%蔗糖,培养基最佳pH5.6,叶片和根状茎愈伤组织增殖的最佳植物生长调节剂组合均为2.0mg·L~(-1)?6-BA+0.8mg·L~(-1)NAA,且根状茎愈伤组织的诱导率和增殖倍数均明显高于叶片。根状茎愈伤细胞悬浮培养的最佳接种量80g·L-1,最佳植物生长调节剂组合1.5mg·L~(-1)6-BA+0.6mg·L~(-1)?NAA,细胞生长曲线与多糖含量变化曲线均呈"S"形,细胞最佳继代周期16d,多糖含量在培养14d时最高,培养基pH呈先下降后上升然后趋于稳定趋势。     

丹参胚性愈伤组织的诱导和细胞大量培养体系的建立

为建立丹参的胚性愈伤组织诱导体系和细胞快速生长体系,用于丹参离体药物生产和体细胞诱变育种,本研究通过不同外植体、不同激素的配比、胚性愈伤组织诱导,继代培养的研究,筛选出细胞生长速度最快、质量最好的培养基配方。研究结果显示,根系和茎段更容易形成愈伤组织。然而,从叶片与茎段诱导出的愈伤组织质地较硬、数量较少,生长缓慢,容易老化,内部褐变并木栓化。从根的伤口诱导的愈伤组织质地松散、数量多、生长旺盛,为黄绿色。因此,选择根系作为丹参愈伤组织药用成分生产的外植体。另外,松散型愈伤组织的初代和继代培养细胞生长快,需要在适当的BA与2,4-D配比中获得。本试验中丹参细胞培养的初代培养的最佳配方为:MS+0.5 mg·L~(-1)BA+0.5mg·L~(-1)2,4-D+30 g·L~(-1)蔗糖,继代培养的最佳培养基配方为:MS+1.0 mg·L~(-1)BA+1.0 mg·L~(-1)2,4-D+30 g·L~(-1)蔗糖。     

葡萄悬浮细胞系的建立

【目的】建立适合葡萄悬浮细胞系快速稳定生长的培养体系。【方法】以鲜食葡萄巨峰的果皮为材料,以B5为基本培养基,通过选择合适的激素配比及浓度、pH、蔗糖浓度等建立并优化葡萄愈伤组织培养体系及细胞悬浮培养体系。【结果】在B5+0.5 mg/L 6-BA+NAA条件下,NAA最适质量浓度为1 mg/L;在B5+0.5 mg/L 6-BA+2,4-D条件下,2,4-D最适质量浓度为1.0~2.0 mg/L;在B5+1 mg/L NAA+6-BA条件下,6-BA最适质量浓度为0.5~1.0 mg/L;在B5+2 mg/L 2,4-D+KT条件下,KT的最适质量浓度0.2 mg/L。在最佳蔗糖质量浓度30g/L、最适pH 5.5~5.8培养基条件下,建立了能快速生长的均一、稳定的巨峰葡萄细胞悬浮体系,优化了培养条件。【结论】适合葡萄愈伤组织生长的培养体系为:B5+250 mg/L水解酪蛋白+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂;适合葡萄细胞悬浮培养的体系为:B5+1 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖和B5+250mg/L水解酪蛋白+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L KT+30 g/L蔗糖。     

老瓜头悬浮细胞培养及其生长特性的研究

以老瓜头嫩茎为材料诱导出愈伤组织,在光照和黑暗条件下进行愈伤细胞的悬浮培养,每隔2 d取样测定相关的生理生化指标.结果表明,老瓜头悬浮细胞的生长曲线呈"S"形,在黑暗条件下生长周期为18 d,弱光条件下24 d,说明黑暗有利于老瓜头细胞生长;在细胞悬浮培养过程中,不同培养条件下,细胞培养液pH值的变化趋势相似,即先下降后上升;老瓜头细胞中可溶性蛋白质的含量变化与细胞生长呈负相关,过氧化物酶活性与细胞生长活力的变化呈正相关.     

花椒愈伤组织诱导及细胞悬浮培养研究

以花椒试管苗叶片为试验材料,研究了不同激素浓度对花椒愈伤组织继代培养的影响,并以多次继代得到的疏松、活性高的愈伤组织建立花椒细胞悬浮系。结果表明:花椒愈伤组织最适继代培养基为MS+2,4-D 1.0mg·L~(-1)+6-BA 0.5mg·L~(-1)+蔗糖30g·L~(-1)+琼脂6g·L~(-1);花椒细胞悬浮培养的最佳培养基和培养条件为:MS+2,4-D 1.0mg·L~(-1)+6-BA 1.0mg·L~(-1)+葡萄糖30g·L~(-1),接种量0.05g·mL~(-1),摇床转速110r·min~(-1),25℃暗培养,该条件下悬浮细胞生长良好,最大生长量为4.52g;花椒悬浮细胞生长呈"S"型曲线,最适继代周期为16d。     

银杏液体悬浮细胞培养产生黄酮的研究

为探索银杏液体悬浮细胞培养条件下产生黄酮的工艺条件,以银杏液体悬浮系为试验材料,在250 mL的三角瓶中装入80 mL液体培养基,置于25℃,100 r/min转速下摇床培养,试验设计分别为光照与黑暗、培养时间、细胞聚集体的大小、前体物对银杏液体悬浮细胞系产生黄酮的影响.结果表明:光照条件下培养14 d黄酮含量最高,3～4 mm粒径的细胞聚集体是黄酮合成的适宜细胞聚集体,前体物L-苯丙氨酸和乙酸钠对黄酮合成无明显的促进作用,且对细胞生长有抑制作用.结论:初步探索到银杏液体悬浮细胞培养条件下产生黄酮的工艺条件,为银杏细胞悬浮培养工业化生产黄酮类物质提供一定的理论基础和技术参数.     

油棕细胞悬浮培养及植株再生技术

【目的】建立油棕胚性体细胞悬浮培养植株再生技术体系,为油棕优株无性系种植材料高效繁育、 细胞生物学研究、生物技术育种研究等提供技术平台和参考。【方法】以源于成龄油棕芯叶的瘤状愈伤组织为 材料,采用不同质量浓度 2,4-D、麦草畏与德夸霉素组合诱导易碎胚性愈伤组织,分析不同激素质量浓度及其 组合对油棕体细胞悬浮系增殖与后续体胚发育的影响。【结果】0.1 mg/L 德夸霉素与一定浓度 2,4-D 或麦草畏 组合,促进胚性愈伤组织形成,0.1 mg/L 德夸霉素与 1 mg/L 麦草畏组合诱导易碎胚性愈伤组织较佳,诱导率为 28.67%;用生长旺盛、质地松散的易碎胚性愈伤组织悬浮培养 21 d 可建立生长状态较均一、分散性好的悬浮 细胞系;0.3 mg/L 德夸霉素与 1 mg/L 麦草畏组合较有利于悬浮细胞系增殖和后续体胚发育;将悬浮细胞系转到 MS+ 谷氨酰胺 100 mg/L + 蔗糖 30g/L 培养基上,于 28（±2）℃、2 000 lx 下进行胚诱导培养,每两周更换新培 养基 1 次,培养 60 d 可获得直径大于 1 mm 的胚,最高每瓶 295 粒;将大于 1 mm 的胚转到固体培养基培养可 获得再生植株。【结论】适当质量浓度德夸霉素与 2,4-D 或麦草畏组合,促进油棕芯叶瘤状愈伤组织形成易碎 胚性愈伤组织;用生长旺盛、质地松散的易碎胚性愈伤组织悬浮培养 21 d 可建立生长状态较均一、分散性好的 悬浮细胞系;初步发现含适当质量浓度德夸霉素与麦草畏液体培养基利于悬浮细胞系增殖和后续体胚发育。     

西洋参细胞悬浮培养体系的建立

目的:建立西洋参细胞悬浮培养体系。方法:通过不同激素和物理影响因素筛选出西洋参细胞培养的最佳条 件。结果:将西洋参愈伤组织接种于附加0.5mg·L-1 2,4-D + 0.1 mg·L-1 KT + 0.2 mg·L-1 NAA 的MS 培养基上最适合 西洋参愈伤组织的生长;用西洋参愈伤组织制作西洋参细胞,发现西洋参悬浮细胞生长曲线类似“S”型;通过改变西洋 参细胞悬浮培养的外界条件发现,西洋参悬浮细胞生长的最佳接种量为1.5 g/30mL,摇床转速和光照条件对西洋参细 胞生长影响没有显著差异。结论:建立了西洋参细胞悬浮培养体系,该技术为西洋参细胞的扩大培养和有效成分的提 取提供了物质基础。     

培养基及培养条件对除虫菊细胞生长的影响

以MS、ER、MG-5、B5、H、1/2MS、M9、NT及White为基本培养基,分析不同类型培养基对除虫菊细胞生长的影响,并以MS为基本培养基进行接种量、培养时间、pH、碳源、蔗糖质量浓度、不同蔗糖和葡萄糖组合以及光照条件试验,探讨除虫菊细胞生长的最佳培养条件。结果表明:适合除虫菊悬浮细胞培养的培养基为MS培养基,细胞接种量为8~12g/L、培养时间为20~25d,pH为5.8,采用自然散射光,单独使用蔗糖作为碳源时,质量浓度为30~40g/L有利于除虫菊细胞的生长。以蔗糖作为碳源时,添加25%的葡萄糖,除虫菊细胞的增长量可以提高12%。     

花生芽组织块悬浮培养产辅酶Q_(10)的研究

【目的】建立花生芽组织块培养合成辅酶Q_(10)(CoQ_(10))方法,为高效生产CoQ_(10)提供参考。【方法】以花生芽组织块为试验材料,考察培养温度、培养时间、蔗糖质量浓度、初始pH值对CoQ_(10)合成的影响。在单因素试验基础上,通过L9(34)正交试验优化培养条件。【结果】花生芽经悬浮培养后,其产CoQ_(10)的最优条件为:培养温度24℃,时间20h,蔗糖质量浓度30g/L,初始pH值6.0,在此条件下CoQ_(10)产量最高,为182.147μg/g,比未经悬浮培养处理花生芽产CoQ_(10)含量提高了72.4%。【结论】建立了花生芽组织块悬浮培养产CoQ_(10)的最佳工艺,且这种工艺操作简便、周期短、成本低。     

橡胶树热研8—79原生质体培养再生植株

【目的】优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础。【方法】以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率。【结果】酶组合为纤维素酶1.50%＋果胶酶0.15%＋离析酶0.50%、酶解时间为12 h时,继代培养第5 d的胚性悬浮细胞达最高产量（3.6 ×107个/mL PCV）;用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5 ×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%。原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株。【结论】通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系。