牛气管抗菌肽在山羊乳腺组织中的表达

根据已经发表的牛气管抗菌肤(bTAP)cDNA序列设计4条短的寡核苷酸片段,以重叠延伸PCR的方法合成bTAP基因,将其克隆至pMD-18T载体,序列测定正确后,构建bTAP基因的乳腺组织特异性表达载体pBcp-bTAP,将其溶于生理盐水后直接注射山羊乳腺小叶,使bTAP基因在乳腺组织内表达,收集注射质粒前后的奶样,测试奶样对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的抑制能力,结果显示注射pBcp-bTAP后的奶样表现出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用,这种抑制活性可以持续至20h以上.     

奶山羊乳房炎的预防与治疗

乳房炎是乳腺、乳池、乳头局部的炎症；多见于泌乳期的山羊。常见的有浆液性乳房炎、卡他性乳房炎、脓性乳房炎和出血性乳房炎。     

基于RNA-seq技术筛选山羊卵泡发育相关下调基因

【目的】对山羊优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF)颗粒细胞进行高通量测序,筛选并研究与山羊卵泡发育相关的下调基因。【方法】以1岁龄贵州白山羊为供试对象,在其发情3 d后,采集第一卵泡波中的优势卵泡(DF)和从属卵泡(SF),分别分离其颗粒细胞,提取RNA并进行文库构建、Illumina测序,将获得的序列与山羊的RefSeq数据库进行比对后,用DESeq2软件对获得的RNA进行差异表达分析,并对表达下调的基因进行GO分析和KEGG信号通路分析,最后通过Real-time PCR对筛选出的表达下调基因进行验证。【结果】将测序结果与山羊的RefSeq数据库比对后,共获得了33 896个基因。经DESeq2软件对获得的mRNA进行差异表达分析,共获得695个差异表达m-RNA,其中462个表达显著下调,233个表达则显著上调;对462个表达下调基因进行GO分析,共分为2大类39组,其中参与生物学过程(BP)的基因占48.7%;与细胞组分(CC)有关的基因占51.3%。KEGG信号通路分析发现20条通路,其中参与癌症通路基因富集最为显著。从下调基因中筛选出6个可能会抑制山羊卵泡发育的基因,分别为PTX3、LDLR、RGN、NID1、PDLIM5、PRLR。Real-time PCR结果显示,RGN、NID1、PDLIM5、PRLR在SF与DF中的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在SF颗粒细胞中的表达量极显著高于DF(P0.01),NID1、PDLIM5在SF颗粒细胞中的表达量显著高于DF(P0.05);PTX3、LDLR在SF与DF中表达量与高通量测序结果相反。【结论】获得的6个表达下调基因在山羊卵泡发育过程中可能会抑制卵泡的发育,最终导致卵泡闭锁。     

山羊DAZL基因的克隆及在山羊骨髓间充质干细胞中的表达

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。     

羊奶低温保存山羊精液技术研究

为探明羊奶用于精液保存的可行性,寻找一种简便的山羊精液保存方法,试验研究并优化了羊奶低温保存山羊精液技术。结果表明:产后1个月的山羊奶离心前后p H和渗透压无显著变化(P0.05),精子在离心后羊奶中保存96 h活率和活力显著高于保存在未离心羊奶中(P0.05);200 m L水浴降温中保存精子活率与50 m L、100 m L、150 m L无显著差异(P0.05),200 m L水浴降温精子活力在72 h、84 h、96 h显著高于50 m L水浴降温组(P0.05);精子在产后1个月的羊奶中保存12~96 h活率显著高于保存在产后2个月的羊奶中(P0.05),保存48~96 h的精子存活率显著高于保存于初乳中(P0.05)。用产后1个月的羊奶保存精子12~96 h,其活力显著高于用初乳和产后2个月的羊奶保存(P0.05);产后1个月羊奶与常规稀释液保存84 h内精子活率无显著差异(P0.05),96 h显著高于常规稀释液(P0.05),产后1个月羊奶与常规稀释液保存60 h内精子活力上无显著差异(P0.05),72 h、84 h、96 h均高于常规稀释液(P0.05)。因此产后1个月羊奶可以作为一种简便的山羊精液稀释液。     

赖氨酸对原代奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白及mTOR信号通路相关基因表达的影响

为了在探究单一添加不同浓度的赖氨酸对原代奶牛乳腺上皮细胞的增殖,以及mTOR信号通路介导的酪蛋白合成相关基因的影响.试验用厄尔平衡溶液(EBSS)代替正常培养基来处理原代奶牛乳腺上皮细胞,在此基础上依次添加不同浓度的赖氨酸,采用MTT法检测细胞12h和24h的增殖和利用qRT-PCR技术检测4个编码酪蛋白基因和8个mTOR信号通路中与乳蛋白合成翻译相关基因的相对表达量.结果表明:添加赖氨酸12h,浓度为0.5~24mmol/L时,原代奶牛乳腺上皮细胞增殖数量增加(P=0.05);添加赖氨酸24h,浓度为0.5~8mmol/L时,细胞增殖数量增加(P0.01).当赖氨酸的添加浓度为0.5~16 mmol/L时,CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因表达均显著上调(P0.01).当赖氨酸添加量为0.5~16mmol/L时,mTOR和raptor基因的表达量显著上调(P0.05).在添加不同浓度的赖氨酸时,下游通路信号因子S6K1、4EBP1和eEF2基因表达均显著上调(P0.01);rps6基因表达上调,eIF4E基因表达下调,但差异均不显著.以上结果表明,补充赖氨酸能显著促进乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成,这一过程与mTOR信号通路介导蛋白质合成相关.     

奶羊乳房炎的防治措施

正乳房炎,在舍饲条件下,奶羊群中的高产羊和经产羊多发,常见于泌乳期的绵羊、山羊,乳腺、乳池、乳头局部出现炎症。1病因一方面是人为因素,挤乳技术不熟练或违规操作损伤了乳头、乳腺体;或分娩后挤奶不充分,乳汁积存过多及乳房外伤;或消毒不严,挤乳工具不卫生等,使乳房受到金黄色葡萄球菌、链球菌、化脓杆菌、大肠杆菌、假结核杆菌     

奶牛COL1A2基因启动子区甲基化与其基因表达及乳腺炎的相关性分析

本研究分析奶牛健康乳腺组织和金黄色葡萄球菌感染的乳房炎乳腺组织中胶原蛋白Ⅰ型α2链基因(COL1A2)启动子区CpG岛甲基化与COL1A2基因表达的调控关系,为奶牛乳房炎的抗性育种及预防提供理论依据。利用生物信息学,分析COL1A2基因启动子区CpG岛分布及其转录因子结合位点;运用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)和RT-PCR法,分析健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中,COL1A2基因启动子区的CpG岛甲基化程度与COL1A2基因表达及乳房炎的相关性。结果表明健康乳腺组织和患乳房炎乳腺组织中CpG岛甲基化差异不显著(P0.05),均呈低甲基化状态(50%),但位于转录因子SP1结合区域内的第4和第5 CpG位点,健康组甲基化程度(30%和60%)显著高于患乳房炎组(0和10%);健康组基因表达水平显著低于患乳房炎组(P0.05)。说明,COL1A2基因在不同乳腺组织中的差异表达可能与其启动子区CpG岛转录因子SP1结合区域内的第4和第5CpG位点甲基化程度差异相关。     

丙酸对山羊小肠上皮细胞糖异生途径关键基因表达的影响

为探究丙酸对山羊小肠上皮细胞(GIEC)糖异生途径关键基因表达是否有影响,试验分为2个部分:第1部分分为4个处理组,分别添加0、0.75、1.50和3.00mmol/L丙酸培养GIEC,6h后收集细胞提取总RNA;第2个部分分为2个处理组,分别添加0和3.00mmol/L丙酸培养GIEC,培养3、6、12和24h时,收集细胞提取总RNA。通过qRT-PCR对糖异生途径关键基因的mRNA表达量进行测定。结果表明,0.75和1.50mmol/L丙酸对PC、FBP1和PGC1A的mRNA表达量无显著影响(P0.05);1.50mmol/L丙酸可显著增加PCK2的mRNA表达量(P0.05);3.00mmol/L丙酸可显著增加PCK2和PGC1A的mRNA表达量(P0.05),还可上调PC和FBP1 mRNA表达量但无差异(P0.05)。与未处理组相比,3.00mmol/L丙酸在6h时可极显著上调PCK2和PGC1A的mRNA表达量(P0.01),还可增加PC和FBP1的mRNA表达量(P0.05);在12～24h对糖异生途径关键基因没有影响(P0.05)。综上,丙酸可以在山羊小肠细胞中诱导糖异生途径关键基因PCK2、PC、FBP1和PGC1A的mRNA表达,并且PCK2在山羊小肠上皮细胞糖异生途径中发挥关键作用。     

褪黑激素对长毛兔毛囊细胞凋亡的影响

为研究褪黑激素对皖系长毛兔毛囊细胞凋亡的影响及相关机制,选择60只皖系长毛兔,随机均分成4组,1组不埋植褪黑激素(对照),另3组每只兔按25 mg(低剂量组)、40 mg(中剂量组)和55 mg(高剂量组)分别埋植褪黑激素,饲养70 d后,进行组织病理学观察和RNA的转录组高通量测序及q PCR表达分析。结果表明:通过组织切片观察,证实55 mg褪黑激素处理能有效抑制毛囊细胞凋亡,维持细胞正常形态;通过对高剂量组和对照组测序,得到25个差异表达基因,其中有14个基因上调,11个基因下调,涉及通路包括嗜T细胞病毒感染、坏死性凋亡、甲状腺癌、铁死亡、I型糖尿病和胰岛素信号通路,其中坏死性凋亡、铁死亡通路与长毛兔毛囊凋亡相关;选取4个与凋亡相关的差异表达基因进行荧光定量验证,得到新基因MSTRG.3561表达显著上调,SLC25A5表达下调,但差异无统计学意义。     

LPS注射后小鼠乳腺中β-防御素1 mRNA表达的变化

为了研究β-防御素1(β-defensin 1,Defb1)基因在小鼠乳腺发生炎症反应时的表达变化,本试验以小鼠第4对乳腺组织为研究对象,用LPS诱导小鼠乳腺组织发生炎症,半定量RT-PCR法研究了小鼠乳腺中Defb1 mRNA表达的相对丰度。试验结果表明,与对照组相比,LPS诱导后各时期Defb1基因的表达量均显著增加(P<0.05),9 h时达到最高峰。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

奶羊乳房炎的防治措施

正乳房炎,在舍饲条件下,奶羊群中的高产羊和经产羊多发,常见于泌乳期的绵羊、山羊,乳腺、乳池、乳头局部出现炎症。1病因一方面是人为因素,挤乳技术不熟练或违规操作损伤了乳头、乳腺体;或分娩后挤奶不充分,乳汁积存过多及乳房外伤;或消毒不严,挤乳工具不卫生等,使乳房受到金黄色葡萄球菌、链球菌、化脓杆菌、大肠杆菌、假结核杆菌等细菌感染所     

家畜乳腺炎的流行诊断及防控

正乳腺炎是哺乳期家畜常见、高发病,炎症易引起乳汁不能利用,或导致母畜乳腺机能减退,甚至完全不能泌乳致使被淘汰,损失惨重,应引起足够重视。本文侧重阐释羊、猪和马的乳腺炎的流行和诊断,为养户提供必要的防控或防治方法。1羊乳腺炎1.1山羊乳房炎1.1.1病因和临诊引起山羊乳房感染的微生物和引起奶牛乳房感染的相似,通常凝固酶阴性葡萄球菌感染最普遍,并能引起持续感     

山羊关节炎与脑炎的流行诊断和防控

<正>1病原、流行与病机山羊关节炎与脑炎(CAE)病毒是一种有囊膜的单链RNA病毒,属于逆转录病毒科,慢病毒属。该病毒多个基因上有差别明显的毒株,其毒力也不同。在自然状态下,CAE病毒具有宿主特异性,但绵羊也可能发生试验性感染。将新生绵羊与感染山羊长期混养一般不会引起感染或血清阳转,但是吮吸感染山羊奶的羔羊会发生血清阳转,并可发CAE CAE     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

热应激对中国荷斯坦牛乳腺组织基因表达及信号通路的影响

夏季奶牛热应激问题给奶业生产造成了巨大的经济损失。为揭示奶牛发生热应激后乳腺组织应答反应的分子机制,通过研究热应激奶牛乳腺组织差异表达基因,探究差异基因对乳腺组织转录调控的影响。以8头中国荷斯坦牛为研究对象,分别采集热应激期(8月,温湿指数THI=83.8)和非热应激期(3月,THI=65.8)各4头奶牛乳腺组织,利用HiSeq2000进行转录组测序,并进行生物信息学分析,共发现96个差异表达基因(差异倍数>2),其中上调表达46个,下调表达50个。GO分类结果表明,注释到细胞组分、分子功能和生物学过程的差异基因数量分别为41、38和36个(P<0.05)。KEGG通路分析结果表明,差异基因共富集到18条信号通路(P<0.05),其中6条与疾病有关,9条与代谢有关,此外,与免疫应答相关的细胞因子-细胞因子受体相互作用和NOD样受体信号通路明显富集。通过比较热应激和非热应激奶牛乳腺组织转录组,分析差异基因相关信号通路,为进一步了解奶牛发生热应激反应的分子机制奠定基础。     

奶牛乳房炎乳腺膜蛋白的比较蛋白质组学研究

【目的】通过分析临床健康和乳房炎奶牛乳腺组织膜蛋白的差异表达,以期在蛋白质水平探索奶牛乳房炎的发生机理。【方法】采用二维凝胶电泳技术分离了临床健康和乳房炎奶牛的乳腺组织膜蛋白,经考马斯亮蓝染色后PDQuest 7.4软件匹配、检测凝胶中差异表达的蛋白点,对12个差异蛋白点采用高效液相色谱串联离子阱质谱分析,SEQUEST软件搜索NCBInr数据库。半定量RT-PCR分析差异表达蛋白的mRNA水平。【结果】12个差异蛋白点鉴定为11种蛋白质,其中9个蛋白点在临床型乳房炎奶牛乳腺组织膜蛋白中表达量上调而3个蛋白点表达量下调,主要涉及细胞膜骨架系统、信号转导、物质结合和传递等生物学功能。半定量RT-PCR分析表明,乳房炎奶牛乳腺组织中钙粒蛋白B的mRNA表达水平是健康奶牛的1.6倍。【结论】推测这些差异蛋白的表达变化与奶牛乳房炎发生相关,为从蛋白质水平揭示奶牛乳房炎的发生机理以及发现潜在的治疗目标蛋白提供了理论依据。     

孕期纳米银暴露对子代小鼠乳腺的影响

以FVB-GFP小鼠为实验动物,从怀孕第12 天开始,对小鼠进行连续1周的灌胃处理,然后对子一代青春期小鼠的子宫、肝脏、乳腺导管形态、乳腺干细胞等进行定性与定量分析,并对纳米银在乳腺癌发生中产生的作用进行评估。灌胃时,将10只3月龄雌性小鼠平均分为2组,分为对照组(超纯水)和纳米银处理组(50 mg·kg^-1),在子代小鼠生长到3月龄时,收集子宫、肝脏等脏器和乳腺组织并进行乳腺干细胞的培养。结果表明,孕期纳米银暴露可以改变子代小鼠乳腺导管的发育,产生炎症反应,并进一步影响乳腺干细胞的数目与形态,改变乳腺干细胞的生长与分化能力。     

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的体外诱导表达

[目的]为了探索山羊乳腺上皮细胞体外诱导表达的技术体系,评价乳腺特异性载体效率及外源蛋白在细胞水平的表达情况。[方法]用含5mg/L胰岛素、5mg/L催乳素、1mg/L氢化可的松的DMEM/F12培养液对转染人乳铁蛋白基因的山羊乳腺上皮细胞进行体外诱导培养,每6h收集1次上清液。上清液浓缩后分别用SDS-PAGE和Westernblot检测外源蛋白的表达情况。[结果]诱导培养液中有目的蛋白表达,分子量约为42kD。[结论]该研究所用的山羊乳腺细胞诱导表达方法能够诱导山羊乳腺上皮细胞表达外源基因,这为人乳铁蛋白基因的异源表达与乳腺生物反应器的研究奠定了基础。