原发性肝癌的自杀基因治疗

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，传统的治疗方法主要是手术切除，放射治疗和化学药物治疗。这些疗法对早期肝癌可获得较满意的疗效，但对晚期肝癌伴有局部扩散和远处转移者，疗效往往较差。分子生物学的发展使基因治疗成为可能。肝癌基因治疗策略主要包括：①免疫基因治疗，又称细胞因子基因治疗，通过转导细胞因子基因，增强机体抗肿瘤免疫能力；②自杀基因治疗，使肝癌细胞产生对某些药物前体的特异敏感性而被杀灭；③基因置换或补充，置换突变的基因或补充缺失的抑癌基因；④反义核苷酸技术，用于抑制癌基因的表达。其中自杀基因治疗是近年来研究的一个热点，本文对近年来肝癌的自杀基因治疗研究情况作一综述。     

基因治疗在皮瓣修复中的应用

基因治疗(gene therapy)是指应用基因工程和细胞生物学技术．将正常基因转移到体内．以期通过导人外源目的基因．补充缺失或失去正常功能的蛋白质或细胞因子．或者抑制体内某些基因过盛表达而达到治疗疾病的一类方法。基因转移技术作为主要治疗方法或外科手术的辅助疗法渐获重视。动物实验业已证明：系统性抗氧化剂和局部或全身应用血管生成因子能提高缺血皮瓣的成活率。现就基因治疗在皮瓣修复中的应用作一综述。     

5-Aza-CdR激活肝癌细胞Runx3基因表达及其临床意义

目的:通过检测肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中Runx3基因启动子区域甲基化状态,探讨肝癌细胞系经药物5-Aza-CdR处理后Runx3基因重新表达的可能性及对细胞生长的影响,寻找抗癌治疗的药物新靶点。方法:采用DNA甲基化特异性PCR(MSP)技术分别对5种肝细胞癌细胞系Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测,用药物5-Aza-CdR2μmol/L处理肝癌细胞HepG23d,继续常规培养5d后,RT-PCR检测Runx3 mRNA表达情况,利用集落形成实验观察细胞的生长活性,应用显微镜观察细胞形态及凋亡变化。结果:在5种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常;肝癌细胞HepG2经5-Aza-CdR处理后,HepG2细胞检测出Runx3基因重新表达,细胞克隆形成率显著降低,显微镜观察显示部分细胞体积缩小、形态趋于规则及凋亡细胞明显增多。结论:Runx3基因启动子区域甲基化可能是导致Runx3基因失活的主要原因之一,去甲基化制剂5-Aza-CdR能有效激活Runx3基因重新表达,抑制肝癌细胞生长,诱导部分肿瘤细胞凋亡。     

肝癌细胞系中Runx3基因表达及启动子区异常甲基化分析

目的：通过检测6种肝癌细胞中Runx3基因异常甲基化状态及表达情况,探讨药物5-aza-2＇-deoxycytidine（decitabine）激活Runx3基因重新表达的能力及对肝癌细胞生长的影响。方法：采用DNA甲基化特异性PCR（MSP）技术分别对6种肝细胞癌细胞系Runx3基因启动子区域甲基化状态进行检测,同时采用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测5种肝癌细胞中Runx3的表达情况及药物5-aza-2＇-deoxycytidine处理其中3种肝癌细胞前后Runx3表达变化。结果：6种肝癌细胞系中,有3种细胞Runx3基因启动子区域存在甲基化异常,药物5-aza-2＇-deoxycytidine处理3种肝癌细胞后,Runx3基因明显表达或表达活性增强。结论：启动子区异常甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一,与肝细胞癌发生早期密切相关,可作为肝细胞癌早期诊断的分子标记物及分子治疗的靶点。     

人乳头瘤病毒16型E6和E7癌基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响

人乳头瘤病毒的16型E6和E7癌基因已广泛用于建立哺乳动物的永生化细胞,但能否用于建立鸡的永生化细胞尚不清楚。试验究克隆人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6和E7癌基因,分别构建这两个病毒癌基因的逆转录病毒表达载体,包装成逆转录病毒颗粒,感染鸡前脂肪细胞后,采用MTT比色法检测E6和E7基因对鸡前脂肪细胞增殖的影响。结果表明,与对照组相比,E7基因显著促进鸡前脂肪细胞增殖,而E6基因则作用不明显。本研究为E6和E7基因在鸡细胞永生化研究奠定基础。     

RNA干涉技术及其在哺乳动物中的应用进展

RNA干涉(RNA interference,RNAi)作为一种有效的用于转录后基因沉默,从而抑制特定基因表达的技术,近年来在哺乳动物细胞中的研究已取得了长足发展,且在基因功能以及疾病治疗的研究中有着广阔的应用前景。研究表明,哺乳动物细胞中的RNAi作用方式与植物有所不同,笔者对哺乳动物RNAi技术的发展、作用机制及其在基因功能、基因治疗、转基因动物研究、药物开发等方面的应用做了综述。     

早期生长反应基因-1与肿瘤关系的研究进展

早期生长反应基因-1(Early growth response gene-1,Egr-1)是一种能在多种刺激因子的作用下诱导其快速短暂表达、对细胞生长起调节作用的基因,属即刻早期基因家族。这一家族主要包括Egr-1、Egr-2、Egr-3、Egr-4、WT-1、c-jun和f-fos等,其中c-jun与f-fos属癌基因;WT-1是肾母细胞瘤的抑癌基因;研究表明Egr-1在多种恶性肿瘤中表达缺失,外源性Egr-1的导人有抑制肿瘤细胞生长的作用,可能作为一种抑癌基因;Egr-1还参与细胞的多种辐射生物学效应,其正常表达有助于提高肿瘤细胞的辐射敏感性。     

自杀基因治疗鼻咽癌的研究现状

鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤,放射治疗是首选,但效果尚不理想。肿瘤自杀基因疗法是一种具有很大临床应用前景的治疗策略,应用于鼻咽癌治疗的研究才刚起步,本文就自杀基因治疗鼻咽癌的研究现状做一综述。     

FRET检测tk基因诱导ACC-M细胞凋亡

研究肿瘤细胞凋亡是进行其药物筛选的重要方法之一。利用已构建的基于Caspase酶的指示剂CD3质粒与HSV-tk／ACV系统结合，通过荧光能量共振转移（FRET）技术研究了细胞凋亡，并采用ACV药物诱导表达了TK-GFP-CD3的ACC-M肿瘤细胞和CD3的ACC-M肿瘤细胞。结果表明，FRET成像检测分析出ACV药物能够诱导转有TK基因的人涎腺癌（ACC-M）肿瘤细胞凋亡，通过对仅转有CD3质粒的ACC-M肿瘤细胞没有影响。这种技术的结合可以用于细胞的凋亡药物的筛选。     

HSV_1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。     

牛巴贝斯虫DXS基因的克隆和真核表达

【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器,在病原体中,它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径,异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础,对有机体生命活动至关重要,例如,在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构,在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体,这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶（DXS）为该途径中的第一个限速酶。因此,针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶dxs基因进行克隆和序列分析,并对其进行真核表达和活性检测,以期获得具有活性的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶,为进行针对该酶的特异性抑制剂的筛选奠定基础。【方法】首先采用反转录PCR技术从牛巴贝斯虫陕县株总RNA中扩增出DXS基因的全长cDNA,并对其进行克隆测序,对测序结果进行序列分析,将阳性克隆亚克隆至带荧光标签的真核表达载体,利用脂质体转染法将重组真核表达质粒转染至Hela细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染细胞的表达情况,消化收集转染细胞,通过超声破碎后采用Western blot技术对DXS蛋白的表达情况进行检测,结合G418压力筛选以及有限稀释的方法对转染阳性细胞进行筛选,获得阳性单克隆细胞。在体外建立DXS酶反应体系,并利用液相质谱联用技术对表达产物的体外活性进行检测。【结果】扩增得到的DXS基因全长共2 061 bp,共编码686个氨基酸,与GenBank上T2Bo株相应基因相似性达到98.0%。利用生物信息学方法对该蛋白质的二级结构进行分析发现,该酶具有3个结构域,分别是焦磷酸硫胺素结合区域;焦磷酸硫胺素嘧啶环结合区域;转酮醇酶C端区域,该酶属于常见的TPP依赖蛋白酶家族。通过倒置荧光显微镜观察,转染重组质粒后的Hela细胞呈现绿色荧光,Western blotting结果显示融合绿色荧光蛋白的DXS酶大小约为102 kD,表明构建的真核表达重组质粒在Hela细胞中进行了正确的表达。通过结合G418加压和有限稀释法筛选得到稳定转染重组质粒PEGFG-DXS的阳性单克隆细胞。利用质谱技术检测到在细胞粗提物与反应混合物反应后的产物中有分子量与DOXP相同的产物存在,在阳离子模式下m/z=237,表明表达产物具有催化活性。【结论】成功的表达了具有活性的牛巴贝斯虫DXS酶,并对融合蛋白的活性进行了定性分析,为今后开展针对DXS酶的特异性化合物体外高通量筛选研究提供了材料。对研究针对DXS为靶标的抗原虫药物具有重要意义,为深入研究该酶的酶学性质和特异性抑制剂筛选奠定了基础。     

SOCS2真核表达载体的构建及在3T3 L1前体脂肪细胞中的表达

细胞因子信号抑制蛋白(SOCS)是细胞因子信号通路的重要负调控因子.构建SOCS2真核表达载体并转染3T3-L1前体脂肪细胞,为研究SOCS2对不同细胞因子调控脂代谢奠定基础.取小鼠皮下脂肪提总RNA进行RT-PCR,克隆获得pMDl8-SOCS2质粒载体,双酶切目的基因,并克隆至质粒载体pcDNA3.1,成功构建了重组质粒载体pcDNA3.1-SOCS2;重组质粒瞬时转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,RT-PCR和Westem blotting检测重组质粒转染组SOCS2核酸和蛋白表达,表达水平均显著高于对照组,为进一步研究SOCS2基因对不同细胞因子调控脂肪代谢提供基础.     

CCND1基因与乳腺癌和他莫西酚耐药的关系

乳腺癌是少数对于激素治疗敏感的肿瘤之一,内分泌治疗效果明确;他莫西酚（TAM）是乳腺癌的一线内分泌治疗药物,然而其耐药问题始终困扰着临床医师。CCND1基因是近年来确定的癌基因,在多种人类肿瘤中具有异常表现,与乳腺癌的关系尤为密切,是近年来研究较为深入的基因。目前研究表明：CCND1基因的表达与乳腺癌的发生、相关标记的表达（如雌激素受体ER）、他莫西酚治疗敏感性及预后具有相关性。本文综述CCND1基因与乳腺癌的关系,及CCND1基因与乳腺癌他莫西酚治疗敏感性的关系。对于CCND1基因与乳腺癌关系的研究,有助于理解乳腺癌的发生机制及雌激素在乳腺癌中的作用方式。CCND1基因可能成为乳腺癌基因治疗的新靶点,并在乳腺癌患者的内分泌治疗筛选中起到重要作用。     

抑癌基因PTEN与细胞凋亡关系的研究进展

PTEN是近期发现的一种新型肿瘤抑制基因,现已证明PTEN基因是第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,不仅参与细胞周期的调控,而且调节细胞的正常生长和发育,最终促进细胞凋亡。PTEN基因是继p53之后,另一个在肿瘤细胞中突变与缺失较为广泛,与细胞的生长及凋亡关系密切的抑癌基因,现就其与细胞凋亡的研究进展作一综述。     

鼻咽癌基因治疗的研究进展

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma.NPC)是华南地区高发的恶性肿瘤之一 ,多发生于年轻人 ,病变位置隐蔽。目前鼻咽癌首选放射治疗 ,尽管癌细胞对放射治疗敏感 ,但仍有较高的复发和 (或 )远处转移率 ,再放疗效果较差。不少学者正在探索更有效的方法 ,如放射与化学药物联合治疗、放射与热疗联合应用和放射加中药治疗。随着重组 DNA技术的发展 ,肿瘤基因治疗得到迅猛发展 ,依据肿瘤本身及发生机制而制定的基因治疗方案和临床应用已成为肿瘤治疗的热点。本文就基因疗法在鼻咽癌中的研究进展作一综述。1　p5 3基因疗法抑癌基因 p5 3是迄今发现…     

低氧诱导因子-1与肝癌的研究现状

低氧诱导因子-1（HIF-1）是由两个亚基组成的异源二聚体体蛋白,其活性主要是由a亚基的稳定性来调节。它在低氧条件下被激活,特异性地与靶基因的低氧反应元件结合,并诱导靶基因转录,提高肿瘤细胞的低氧适应能力,利于其生长、增殖、转移。其机制包括促进肿瘤干细胞的分化,调节肿瘤细胞的代谢,促进肿瘤新生血管形成,抗肿瘤细胞凋亡等。近年有许多关于HIF-1与肝癌及肝癌细胞的研究,本文综述了其与肝癌发生、发展和治疗的研究现状。     

利用CRISPR/Cas9技术构建永生化脐带间充质干细胞系及MYC-AS1转基因研究

人脐带间充质干细胞(hMSCs)是一种具有多向分化潜能的多能干细胞,在组织修复和某些疾病治疗的临床应用上发挥着重要作用.利用CRISPR/Cas9技术在腺相关病毒AAVS1位点插入具有磷酸甘油酸激酶PGK启动子和SV40-polyA的SV40 LT基因,使hMSCs达到永生化.并利用慢病毒构建具有抑癌作用的反义长链非编码RNA MYC-AS1转基因的hMSCs,从该细胞系的培养液中分离提取表达MYC-AS1的外泌体.通过处理肝癌HepG2细胞,研究外泌体对HepG2表型的影响.结果表明:与野生型MSCs相比,永生化细胞MSCs-SV40增殖显著加快,但其定向分化特性并未改变,可在体外稳定传代超过40代,且未发现成瘤性.MYC-AS1转基因hMSCs的外泌体能表达MYC-AS1,且显著抑制HepG2肿瘤细胞的增殖和迁移.这一研究通过CRISPR/Cas9技术敲入SV40LT基因成功构建了 hMSCs,其MYC-AS1转基因细胞的外泌体对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑制作用,这对hMSCs及其外泌体的基础研究和临床应用研究具有重要意义.     

表达sFat-1基因慢病毒载体的构建及病毒生产

为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。     

山羊FGF1基因腺病毒超表达载体的构建

【目的】为利用超表达手段进一步研究成纤维细胞生长因子1(FGF1)基因对山羊肌内前体脂肪细胞分化过程的影响。【方法】本试验通过构建p Ad Track-CMV-FGF1穿梭质粒,转入含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,获得腺病毒超表达载体pAdEasy-FGF1,经Pac I酶切鉴定后转染293A细胞进行病毒的包装与扩繁,最后用包装的pAdEasy-FGF1感染山羊肌内前体脂肪细胞,检测感染前后FGF1的表达变化。【结果】成功构建了腺病毒超表达载体p AdEasyFGF1,并在293A细胞中成功包装,其感染山羊肌内前体脂肪细胞能显著上调FGF1 mRNA的表达水平。【结论】说明FGF1基因可以通过感染重组腺病毒表达载体pAdEasy-FGF1在山羊肌内前体脂肪细胞中实现超表达。     

核转录因子кB系统与肿瘤放射敏感性

离子化辐射可诱导许多早期反应基因的表达 ,包括 c- fos,c-jun,egr- 1,p5 3和 NFк B,这些早期反应基因编码的核转录因子 ,经由多条信号传导途径 ,进行细胞间及细胞内的信息传递 ,对于受照射的细胞起着重要的保护作用。凋亡是肿瘤细胞在放疗作用下最主要的被清除的方式。近年来许多研究发现 ,NFк B的活化和表达与肿瘤细胞抵抗辐射诱导的凋亡有关 ,电离辐射在诱发细胞凋亡的同时 ,也激活了 NFк B。因此 ,研究离子化辐射诱导的早期基因 ,更有助于阐明有关的细胞应激反应中的分子事件及生化事件。1　 NFк B系统的生物学特性在哺乳动物…