黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的检测与分析

【目的】检测黑龙江省稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t在不同地区、年份间流行菌株的分布情况与变异机制,了解其等位基因的致病表型,为黑龙江省抗瘟品种布局提供参考依据。【方法】利用NCBI中公布的无毒基因序列对3个无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t的基因全长和编码序列（coding sequence,CDS）分别设计特异性引物,将2016年和2017年采自黑龙江省不同地区335个稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,并挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行致病型测定。【结果】在PCR电泳检测中AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t均出现特异性条带,说明这3个无毒基因在黑龙江省均有分布,并以不同分布频率与突变类型出现。3个无毒基因平均扩增频率分别为75.52％、87.16％和85.67％。其中AVR-Pib通过电泳检测与PCR产物测序检测出4种带型（无带、高带、中高带与低带）和5种变异类型AVR-Pib（1-1、1-2、2、3、3-1）,基因型AVR-Pib-1-1、AVR-Pib-1-2、AVR-Pib-2和AVR-Pib-3-1为新发现的变异类型,其中基因型AVR-Pib-1-1和AVR-Pib-1-2均为转座子Pot2的插入,但插入位点不同;基因型AVR-Pib-2在阅读框上游存在小片段的插入;基因型AVR-Pib-3-1碱基序列与原序列比对有4处差异,即32（C/G）35（T/A）36（T/A）38（T/A）,导致氨基酸翻译提前终止。对检测到的5种等位基因型进行致病型测定,分析发现除正常基因型AVR-Pib-3外,其他变异基因型无毒功能均已丧失。而AVR-Pik经PCR产物测序检测出7种等位基因型,AVR-Pik（D、A、B、C、E、F、F2）,碱基序列的变化均导致氨基酸错义突变,7种等位基因型均已见报道。无毒基因AvrPiz-t通过电泳检测和PCR产物测序分析,发现2种带型（高带和正常带型）与4种基因型AvrPiz-t（A、B、C、D）,其中AvrPiz-t-A为正常基因型;基因型AvrPiz-t-B在191位处有碱基A的插入,导致氨基酸翻译提前终止;基因型AvrPiz-t-C为新发现的等位基因型,其特点在于与A类型存在17（T/C）和19位处碱基C的插入,发生移码突变翻译提前终止;高带型对应的无毒基因型AvrPiz-t-D经测序验证为Pot3转座子的插入。4种基因型菌株分别接种水稻单基因系发现,AvrPiz-t-A可以被Piz-t识别表现无毒,AvrPiz-t（B、C、D）均不能被Piz-t所识别而表现为有毒性。【结论】黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pib、AVR-Pik和AvrPiz-t分布较为广泛,且变异类型丰富,研究结果可为选育和推广携带相应抗病基因的水稻品种提供参考。     

黑龙江省和海南省稻瘟病菌中AVR-Pita家族的分布及变异分析

【目的】通过检测黑龙江省和海南省不同稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株群体中AVR-Pita家族的分布情况和变异特征，了解其变异类型的致病表型，为区域内抗病种质的筛选与选育提供参考。【方法】通过参考NCBI中公布的AVR-Pita家族序列分别对启动子区和CDS区设计特异性引物共6对，对2020年采自黑龙江省和海南省不同地区的397个稻瘟病菌单孢菌株提取DNA，进行PCR扩增。通过电泳检测结果，分别选取囊括不同地区的代表菌株对扩增片段进行测序。测序结果与NCBI中相应的碱基与氨基酸序列进行比较分析，并利用水稻抗性单基因系，对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行无毒功能验证。【结果】在PCR电泳检测结果中，黑龙江省稻瘟病菌菌株携带所有待测基因，分布广泛且检出频率较高；而海南省稻瘟病菌菌株中仅携带AVR-Pita1和AVR-Pita2，并以低频率集中存在。无毒基因组成分析结果显示，黑龙江稻区的稻瘟病菌菌株复杂多样，携带的基因型种类较海南菌株丰富。PCR产物测序检测结果显示，AVR-Pita家族以点突变、插入和缺失为主要变异类型划分为19种,且不同稻瘟病菌群体来源的菌株，其变异类型...     

黑龙江省和海南省PWL基因家族在稻瘟病菌中的分布及变异

【目的】了解不同稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）菌株群体中PWL基因家族的分布和变异特征，为研究不同稻瘟病菌群体的遗传多样性及特异性提供依据。【方法】通过参考NCBI中公布的无毒基因序列分别对PWL基因家族的启动子区和CDS区设计特异性引物共8对，对2020年采自黑龙江省和海南省不同地区的397个稻瘟病菌单孢分离菌株提取DNA，进行无毒基因的PCR扩增并通过琼脂糖凝胶电泳检测，从检测结果中分别选取囊括不同地区的代表菌株对扩增片段进行测序分析。测序结果与NCBI中相应无毒基因启动子区和CDS区的碱基与氨基酸序列进行比较分析。【结果】在PCR电泳检测结果中，PWL1在所有菌株中均未检测出；PWL2、PWL3和PWL4在黑龙江省和海南省中均扩增出特异性片段，说明这3种基因在两省中均有分布并分别存在不同的分布频率与变异类型。其中PWL2在黑龙江省和海南省中分布频率最高，分别为98.14%和100%;PWL3和PWL4在两省中的分布频率具有显著差异，这2种基因在黑龙江菌株中频率分别为89.30%和82.79%，而在海南菌株中均为5.49%。通过对无毒基因组合进行分析，结果显示，组...     

广东省侵染美香占2号的稻瘟病菌致病性及无毒基因变异分析

[目的]分析侵染广东稻区优质品种美香占2号稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的致病性及无毒基因变异特征,为美香占2号在不同稻区的合理布局提供参考依据.[方法]利用9个抗稻瘟病单基因系,对稻瘟病菌单孢分离菌株进行致病性测定;并利用8个稻瘟病菌已克隆无毒基因的功能性分子标记对2013-2018年不同年份、不同...     

黑龙江省水稻种质稻瘟病抗性评价及抗瘟基因结构分析

[目的]稻瘟病严重威胁黑龙江省水稻的生产,选育和利用抗瘟品种是最经济、安全和有效的措施.了解黑龙江省水稻主栽品种的稻瘟病抗性,明确稻瘟病抗性基因的有效性,为黑龙江省稻瘟病抗病种质资源的选育和利用提供依据.[方法]2018年秋季在黑龙江省水稻主产区采集134株水稻单孢菌株,采用病原物接种鉴定方法对黑龙江省50个水稻主栽品...     

绿僵菌mad2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

【目的】昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性。已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一,在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用,但其作用机理知之甚少。本研究通过构建金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）mad2敲除突变株（Δmad2）,探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响。【方法】从NCBI中获取mad2前后基因组DNA序列,设计扩增mad2前后同源臂特异性引物,以绿僵菌基因组DNA为模板,扩增得到前后同源臂基因S1、S2;设计特异性引物Hyg-F/R,以pKH-KO载体为模板,扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因hyg;再通过overlap PCR构建mad2的同源敲除盒S1H、S2H;最后利用PEG介导的原生质体转化,获得稳定遗传的mad2敲除株。通过对比敲除株与野生株（WT）的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化,分析MAD2蛋白的生物学功能。【结果】原生质体转化获得了敲除mad2的同源重组转化子;敲除株与野生株对比分析表明,敲除株的孢子萌发率显著低于野生株,萌发中时间比野生株延长5.47 h;培养12 h和14 h时,敲除株的菌丝长度显著均小于野生株,分别为野生株的77.8%和76.3%;培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3%。敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低,但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响。敲除mad2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力。敲除株处理花生12 h后,与野生株处理相比,花生共生受体SYMRK、钙信号解码相关基因（CaM、CCaMK和DELLA）、脂质氮素转运相关基因（LTP1、NRT24、ABCC2）的转录水平出现显著下调;而与空白对照相比,mad2缺失后SYMRK转录水平仍有一定的上调,CaM、CCaMK和DELLA的转录水平产生显著抑制,对ABCC2、LTP1、NRT24的转录无明显影响。【结论】金龟子绿僵菌黏附素MAD2影响菌株的孢子萌发、早期菌丝生长、产孢及对植物的黏附力,但对昆虫的黏附和杀虫毒力无影响;在菌株与花生互作早期,MAD2触发了花生共生基因的转录。     

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

【目的】CAP（Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1）超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。【方法】通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因;利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测;使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析;利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式;使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因;利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补;以遗传霉素（G418）抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体;以潮霉素（HPH）抗性为筛选标记获得基因回补菌株;通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响;通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。【结果】在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因,分别命名为VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c。序列特征分析发现,3个CAP蛋白均包含4个保守区：N端信号肽、N端延伸区（NTE）、CAP保守功能域和C端延伸区（CTE）。系统发育分析显示,3个CAP蛋白聚于不同的进化支,VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉（Neurospora crassa）CAP蛋白进化关系较近;VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属（Fusarium spp.）CAP蛋白的进化关系更近;VmPR1c聚于clade1,并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示,VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c在病菌侵染早期（6 h和12 h）均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c敲除突变体（ΔVmPR1a-7/23、ΔVmPR1b-20/31和ΔVmPR1c-26/40）;营养生长观察发现,所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异;致病力检测发现,ΔVmPR1b-20/31致病力较野生型无明显变化,而ΔVmPR1a-7/23和ΔVmPR1c-26/40致病力较野生型显著下降。将VmPR1a和VmPR1c分别回补至ΔVmPR1a和ΔVmPR1c,回补菌株（VmPR1a/C和VmPR1c/C）致病力恢复至野生型水平。【结论】苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因（VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c）,其中VmPR1a和VmPR1c是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。     

辽宁省稻瘟病菌无毒基因型鉴定及分析

【目的】鉴定稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的无毒基因型,了解无毒基因在不同地区流行菌株中的分布情况,为品种布局提供参考。【方法】根据已经克隆且与稻瘟病菌致病性相关的6个无毒基因序列设计引物,选取辽宁省稻瘟病常发区的26株稻瘟病菌单孢菌株,提取各菌株DNA样本作为模板,进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳及PCR产物测序,对6个无毒基因PCR产物进行碱基和氨基酸序列的分析比较。对琼脂糖凝胶电泳未出条带的,设计不同引物进行验证性试验。【结果】在PCR产物电泳检测中,Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii没有产物条带,对这3个无毒基因设计验证引物,其PCR产物电泳检测仍没有条带出现,其结果证明辽宁省各水稻主产区流行稻瘟病菌中多不携带Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii;对于其他3个无毒基因 AvrPiz-t、Avr-pik和Avr-pita则有特异性扩增产物,说明这3个无毒基因在各稻区稻瘟病菌中以不同突变类型及不同频率出现。其中,与Pi2、Pi9和Piz-t对应的AvrPiz-t,分别在22个菌株的中被检测到,且有21个菌株的序列与其序列一致,说明该基因遗传相对稳定,也间接证明携带Pi2、Pi9和Piz-t 的水稻品种在辽宁地区的广谱抗性;与基因组序列不同的16号菌株,在DNA序列192 bp处发生一个单碱基C的缺失,从而导致移码突变,且碱基突变导致氨基酸序列至72位氨基酸时提前终止,而使该基因编码的蛋白质失去无毒基因的功能。与Pik、Pik-p、Pik-m和pik-s对应的Avr-pik,电泳检测结果表明各菌株均有特异性条带出现,经测序验证等位基因序列分为4种类型（B、D、F、G）,其中12个菌株携带可为Pik或其等位基因Pik-m和pik-p所识别的D类型;9个菌株携带B类型,该等位基因曾被报道,但是否具有无毒基因的功能仍未验证;另有2个菌株携带F类型等位基因,该基因为首次发现,并分别出现在丹东和盘锦地区。其特点在于与D类型基因间存在143（A/G）的碱基差异,氨基酸序列翻译结果显示其为错义突变,即48（G/D）;而其余3个菌株携带G类型等位基因,该基因亦属首次发现,且仅出现在抚顺新宾地区,碱基序列与D类型存在168（G/A）的差异,导致翻译提前终止,基因功能丧失。对于Avr-pita,26个菌株特异性扩增产物一致,但测序检测到5种等位基因类型,且均与Avr-pita有差异,碱基序列的变化多导致错义突变。这5种等位基因的氨基酸序列之间差异由3个氨基酸位点的差异所致,分别为83（D/N）、192（Y/C）和207（K/R）,3处突变均在基因结构域范围内,几种等位基因均已见报道。【结论】辽宁稻区流行稻瘟病菌中Avr-pik、AvrPiz-t和Avr-pita分布较为广泛,选育及推广携带相应抗病基因的水稻品种可减轻稻瘟病的危害。     

绿僵菌黏附素MAD1体外表达及诱导花生响应的作用

【目的】绿僵菌具有昆虫致病性和植物共生性,其黏附素MAD1在绿僵菌侵染寄主昆虫过程中起重要作用。通过体外真核表达MAD1蛋白,明确MAD1在绿僵菌与植物共生中发挥的作用。【方法】以绿僵菌转录组的Unigenes作为参考序列,在GenBank中进行同源性检索比对,设计引物,以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）IPPM010202菌株的cDNA作为模板,克隆得到mad1,通过DNAMAN对mad1序列进行蛋白翻译,利用ProtParam在线工具预测MAD1蛋白氨基酸组成及其理化特性,利用SMART在线程序分析其结构域。构建mad1重组真核表达载体并转化毕赤酵母,获得重组子,通过甲醇诱导表达得到MAD1蛋白;通过Ni-NTA亲和层析获得纯化蛋白。以纯化蛋白溶液（20 μg·mL^-1）浸没处理花生根0.5、6、12和24 h,通过qPCR检测花生根膜受体基因（CERK1、RPK）、免疫相关级联基因（MAPK、MMK1、CDPK）和转录因子基因（MYB86）、细胞壁整合基因（SCW1）及防御相关基因（PTi1、RML1A）的转录水平。【结果】克隆得到了绿僵菌黏附素基因mad1,全长2 136 bp,编码711个氨基酸,分子量约为74.8 kD;生物信息学分析表明,MAD1的N端有信号肽,C端有糖基磷脂酰肌醇（GPI）细胞壁锚定位点,且含有CFEM功能结构域,属于亲水性蛋白。成功构建了MAD1真核表达系统,诱导表达并纯化出具有生物活性的MAD1蛋白,对花生根进行不同时间段的处理,发现MAD1处理后0.5 h,根尖细胞感知并启动膜类识别受体基因CERK1表达;0.5—6 h,根膜受体基因CERK1、RPK转录水平均上调,膜整合基因SCW1转录由下调转为上调,免疫反应相关基因MAPK、MMK1、CDPK、MYB86的转录受到短暂抑制,防御基因PTi1、RML1A转录下调,植物根部免疫防御反应受到抑制;6—12 h,膜受体基因维持上调表达,而防御基因RML1A从下调逆转为强烈上调;12—24 h,膜受体类基因CERK1、RPK,防御基因PTi1、RML1A均上调,免疫相关级联基因MAPK、MMK1、CDPK,转录因子基因MYB86也出现微弱的上调,植物根部启动免疫防御反应。【结论】在绿僵菌与花生根的互作早期,绿僵菌MAD1蛋白 6 h时已激活花生根膜受体基因CERK1和RPK的识别响应,同时抑制花生免疫级联基因MAPK、CDPK、MMK1及防御相关基因如PTi1、RML1A的表达,有助于绿僵菌在花生根组织上定殖;随后诱导花生细胞壁整合基因SCW1上调表达,参与根上受损细胞壁的修复与重建,促进绿僵菌与花生共生关系的建立。诱导植物的免疫抑制和细胞壁重建整合可能是绿僵菌与植物建立共生关系的重要步骤。     

不同苹果砧木实生苗对盐碱复合胁迫的生理响应

【目的】综合评价不同苹果砧木的耐盐碱性,筛选适合新疆南疆盐碱土壤栽培的苹果砧木。【方法】以湖北海棠、小金海棠、八棱海棠、平邑甜茶、野苹果、白海棠、山定子7个4年生苹果砧木为材料,将NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃、Na₂CO₃按1∶9∶9∶1的比例混合,采用盆栽浇灌1/2 Hoagland营养液,模拟浓度为0、15、30、45、60 mmol/L的盐碱复合胁迫,测定7个苹果砧木在盐碱复合胁迫下叶片的叶绿素含量、相对电导率、脯氨酸含量等5项生理指标,利用隶属函数法综合评价各砧木的耐盐性。【结果】随着胁迫强度的增大,各砧木叶片叶绿素含量不断减小,相对电导率和脯氨酸含量总体呈上升趋势,可溶性总糖含量总体呈先上升后下降,可溶性蛋白含量呈先上升后下降和“升高—降低—升高”2种变化趋势。【结论】7种供试苹果砧木的耐盐碱能力由强到弱依次为八棱海棠>野苹果>平邑甜茶>小金海棠>山定子>白海棠>湖北海棠。     

商业酵母在葡萄酒工业化生产中的定殖情况分析

【目的】揭示商业活性干酵母（active dry yeast,ADY）在葡萄酒工业生产中的定殖情况,及其与我国本土酿酒酵母菌株的遗传关系,为我国本土优良酿酒酵母的选育提供理论依据,同时为葡萄酒生产中ADY的使用提供参考。【方法】以宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的‘赤霞珠’葡萄为原料,分别接种BDX、XR、FR和FX10四种ADY发酵,于接种后的1、3和5 d取样。利用Interdelta和SSR技术对酿酒酵母进行菌株区分,分析商业ADY在不同发酵阶段的数量、比例以跟踪其定殖能力。利用PopGen32软件分析其遗传多样性相关指数,采用NTsys2.10e软件揭示商业酵母与宁夏本土酵母的遗传关系。【结果】4种ADY共显示出6种Interdelta指纹图谱即6种基因型：XR和FR均由2种株系组成,BDX和FX10均由1种基因型组成。对于本研究选取的9个微卫星位点而言,每种ADY均显示出1种基因型。4个发酵中共分离到225个酿酒酵母单菌落,Interdelta分析显示42种基因型,其中本土基因型为36种,菌株变异程度为中等16%（36/225）;SSR分析显示20种基因型,其中本土基因型为16种,处于中等遗传多样性水平。9个微卫星位点共检测出75个等位基因,平均每个位点的等位基因数为8.3333个,观测杂合度（Ho）在0.2000—0.5000,PIC在0.6339—0.8620,平均值为0.7614,均为高度多态性位点。接种BDX的发酵中本土基因型最丰富（11种Interdelta类型和8种SSR类型）,接种FR的发酵次之（11种Interdelta类型和6种SSR类型）。商业ADY没有在发酵的各个阶段占据主导地位,对于不同的发酵阶段而言,优势酿酒酵母的基因型也存在差异。Interdelta分析和SSR分析均显示FR不是相应发酵中的优势菌株。BDX虽然存在于整个发酵过程中,但只在接种后的3 d占主导地位。接种XR和FX10的发酵中,Interdelta分析法显示它们不是发酵中的主导菌株,而SSR分析显示它们均是相应发酵中的主导菌株。本土酿酒酵母基因型β（SSR类型为BDX-7）、基因型γ（SSR类型为BDX-6）、基因型A（SSR类型为XR）、基因型a（SSR类型为FX10）、基因型b（SSR类型为FX10）、基因型bb（SSR类型为FR-2）和基因型ee（SSR类型为FR-4）等在相应的发酵中均表现出较强的竞争力。聚类分析表明,分离自相同发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较大。【结论】葡萄酒工业生产中本土酿酒酵母基因型丰富,发酵是由本土酵母与商业酵母共同参与完成的,且二者在发酵中相互竞争,数量动态演替。     

新疆野生阿魏菇原生质体的再生与单核菌株交配型测定

【目的】利用原生质体单核化技术获得具有优良性状的阿魏菇(Pleurotus ferulae)新菌种,为新疆野生阿魏菇新品种的保育及产业化应用提供技术支撑。【方法】采用原生质体制备技术获得阿魏菇单核菌株并进行交配型测定。【结果】酶解3.5 h时,PL01、PL163与 PL176等3株野生阿魏菇亲本菌株的原生质体释放量最大,浓度最高达20.6×10⁵个/ mL,通过优化的原生质体单核化技术最终获得50个单核菌株,亲本菌株PL163、PL01、PL176原生质体单核化率分别为 25.68%、12.8%、10.8%,获得率较低。对其进行了交配型测定,每株亲本菌株得到2种交配型的单核菌株。其中,菌株PL01与PL163、 2种交配型获得比例均为1∶3,而PL1762种交配型获得比例为1∶4。每个亲本菌株与获得的单核菌株在菌丝长速、菌落形态方面均具有差异。以不同交配型的单核菌株PL01-P16、PL01-P49、PL163-7、PL163-24 、PL176-23、PL176-39作为杂交育种材料进行配对,获得12株性状优良的杂交菌株。拮抗反应表明,12株杂交菌株与亲本之间形成明显隆起的拮抗带,与亲本菌株显著不同。【结论】3株阿魏菇野生菌株在原生质体再生单核获得率、长速、形态等方面具有丰富的多样性,获得的杂交菌株为新疆阿魏菇新品种的保护奠定了基础,并为选育优良阿魏菇杂交品种提供了良好的种质材料。     

多重耐药大肠杆菌中前噬菌体的分布特征及诱导分离

[目的]通过调查前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中的分布特征、诱导分离以及前噬菌体中耐药基因与毒力基因的流行状况,为研究前噬菌体介导耐药基因在细菌的传播提供科学依据.[方法]挑选前期保存的2018-2019年广东省分离的131株禽源多重耐药大肠杆菌进行核酸提取及全基因组测序,将二代测序的结果组装拼接成全基因组序列,上传至噬菌...     

广泛靶向代谢组学解析桃蚜危害对桃树次生代谢产物的影响

[目的]阐明桃蚜(Myzus persicae)危害条件下桃树抗蚜和感蚜品种的代谢响应机制,并确定桃树响应桃蚜危害过程中起关键作用的次生代谢产物.[方法]采用抗蚜和感蚜桃树幼嫩新梢进行桃蚜危害处理,取接种3 d的桃树新梢进行次生代谢产物提取,并利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)对抗蚜品种(品系)'96-...     

苹果树腐烂病病原种类及其亲缘关系分析

【目的】研究苹果树腐烂病菌的种类及其亲缘关系,为有效防治苹果树腐烂病提供理论依据。【方法】以阿克苏地区不同区域苹果树腐烂病病样为材料,采用常规组织分离法和枝条烫伤接种法分离和鉴定菌株,记录形态学特征和发病情况;利用分子生物学方法获得β-tubulin与EF1-α序列,在NCBI网站对比分析Blast同源性,采用邻接法构建系统发育树分析同源性。【结果】菌丝生长最适温度 20~30℃,最适pH值为5~6,最适碳氮源分别是葡萄糖和蛋白胨;共分离出11个菌株,将菌株接种到健康苹果枝条上均可发病且能分离出相同的菌株,各菌株分别与Valsa mali和Valsa ceratosperma具有较近的亲缘关系。【结论】阿克苏地区苹果树腐烂病菌为黑腐皮壳属V. mali(无性型C. mali)和V. ceratosperma(无性型C. sacculus),其中V. mali为阿克苏地区的主要致病种,在PDA上存在不同类型的培养性状。     

水稻广谱抗稻瘟病基因PigmR功能标记的开发及应用

【目的】稻瘟病是世界上最严重的水稻病害之一。通过功能标记的开发,为加快广谱持久抗稻瘟病基因PigmR在水稻育种中的应用提供依据。【方法】利用Snapgene 2.3.2软件分析PigmR的碱基变异特征,用Oligo 7设计特异功能标记。为了避免因PCR扩增失败引起的假阴性,设计扩增内参基因Actin1的引物作为参照,对功能标记进行优化。用功能标记对水稻亲本材料、丽江新团黑谷的单基因系材料、育种中间材料和南粳53045/谷梅4号BC₁F₃群体株系进行鉴定。稻瘟病鉴定的供试菌株为江苏省稻瘟病代表菌株（2018-4、2018-65、2018-102、2018-222和2018-241）的混合菌。将供试菌株移植RCA培养基上,25℃培养7 d,用黑光灯照射72 h,待稻瘟病菌产生孢子后,再用无菌水洗下,配成10×10倍显微镜下每视野30—40个孢子的悬浮液。于水稻抽穗前3—4 d注射混合菌株,每穗注射1 mL菌液,做好标记。在水稻灌浆饱满后进行抗性调查。【结果】根据PigmR与PigmS、Pigm-R4序列比对及差异分析,设计了8对分子标记引物。通过分子检测,筛选获得的PigmR功能标记GMR-3,能特异扩增来源于谷梅4号的PigmR,获得98 bp产物,而不携带PigmR扩增不出产物。以不同浓度配比优化GMR-3与内参基因Actin1检测引物Actin1-1,发现以0.4 μmol·L ^-1 GMR-3与0.1 μmol·L ^-1 Actin1-1组合浓度扩增出PigmR和Actin1特征条带的效率相当,效果最优,将该标记命名为GMRA。用该标记扩增水稻样品,携带PigmR的样品能扩增出146和98 bp条带,不携带PigmR的样品仅能扩增出146 bp条带。利用GMRA标记检测229份水稻材料,只有谷梅4号能扩增出146和98 bp条带,其他籼稻和粳稻均只能扩增出146 bp条带。进一步对29份丽江新团黑谷的单基因系材料进行检测发现,GMRA标记能有效区分PigmR与Pi9、Piz、Piz-t等同源性较高的基因,有很好的特异性。利用GMRA标记,从240份育种中间材料中筛选到3份携带PigmR的材料,可作为该基因的供体材料。利用该标记进行分子标记辅助选择,将PigmR通过回交转育到优质食味粳稻南粳53045。对南粳53045/谷梅4号BC₁F₃群体单株进行分子标记检测及稻瘟病人工接种鉴定,发现携带PigmR的单株均表现为抗或中抗,不携带PigmR的单株均表现为高感,表明导入PigmR能显著改良南粳53045的穗颈瘟抗性。【结论】PigmR的功能标记能有效用于抗稻瘟病遗传改良和资源筛选。     

动物源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力与分子分型关系研究

目的调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征,探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性,为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据。方法以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象,用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力,将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定,通过金黄色葡萄球菌常见3种（spa、MLST和PFGE）分型方式进行分子分型,并分析产膜能力与分子型之间的相关性,最后通过全基因组测序技术分析生物被膜产生菌株中耐药基因和毒力基因携带状况。结果结晶紫半定量结果显示,98株金黄色葡萄球菌中能产生生物被膜的菌株共计23株,占23.47%。包括牛乳源22株（占比25.29%,22/87）,其中14株（占比60.87%,14/22）来自浙江奶牛养殖场,8株（占比39.13%,8/22）来自福建奶牛养殖场,以及猪源1株（占比9.10%,1/11）,来自广东屠宰场,说明牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力高于猪源;将产膜能力划分为强、中、弱3个等级,23株产膜菌株中,其中强产膜菌株2株（占比8.70%,2/23）,中产膜菌株9株（占比39.13%,9/23）,以及弱产膜菌株12株（占比52.17%,12/23）。药敏试验显示,牛乳源产膜菌株对所有受试抗菌药物敏感,而猪源产膜菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、头孢西丁、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、多西环素、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明、泰妙菌素、替米考星13种抗菌药均表现出耐药;spa分型结果显示,98株金黄色葡萄球菌共获得8种spa型,产膜的23株金黄色葡萄球菌占其中3种：1株t2922型来自广东猪源,14株t2119来自浙江牛乳源,8株t189来自福建牛乳源;MLST分型结果显示,98株菌共分为9种ST型,其中6种ST型不具有产生生物被膜的能力,分别为ST398、ST522、ST705、ST1651、ST479和ST151,仅3种ST型的菌株具有生物被膜产生能力,分别为ST9、ST7和ST188。结果表明,强产膜菌株分子型主要为ST7-t2119,中产膜菌株主要为ST7-t2119和ST188-t189,弱产膜菌株为ST9-t2922、ST7-t2119和ST188-t189;同时结合PCA分析不同ST型组间差异性发现,弱产膜菌株的ST型能与中强产膜菌株很好的区分开来,只有特定ST型的金黄色葡萄球菌才具有产生生物被膜的能力。23株产膜菌株PFGE分型全部成功,结果显示,广东、福建、浙江三省产膜菌株共分为3种PFGE型,且PFGE型存在地域分布特征,同一地区的分离株可能存在克隆传播,但克隆株之间生物被膜产生能力有明显差异;全基因组测序结果显示,产膜菌株中耐药基因和毒力基因根据分子型不同携带情况呈现多样性。结论不同来源的金黄色葡萄球菌有不同程度产生生物被膜的潜力,且均携带多种不同的产膜基因,牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力远远高于猪源;菌株能否产膜与ST型存在强相关性,特定的ST型如ST9、ST7和ST188更容易产生生物被膜。     

我国草地贪夜蛾种群杀虫剂靶标基因突变分析

【背景】 草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）原产于美洲热带和亚热带地区,是重大迁飞性农业害虫。2016年以来迅速扩散至全球100多个国家,目前已入侵我国27省（自治区、直辖市）,对粮食安全构成极大威胁。化学防治是草地贪夜蛾的重要应急防控措施,经过几年的药剂防治,草地贪夜蛾的抗药性可能会发生变化,进而影响防治策略的有效性。其发生范围持续北扩,而目前2020—2021年国内不同种群及长城防线种群抗药性现状以及年度间变化性研究较少。【目的】 明确我国不同区域种群（包括长城防线）的抗药性现状与差异,为草地贪夜蛾防控的科学用药提供指导。【方法】 采集13省（自治区、直辖市）的草地贪夜蛾田间种群样本,通过对单头样本杀虫剂靶标基因的PCR扩增产物直接测序,分析2020—2021年采自13省（自治区、直辖市）47市（区）草地贪夜蛾种群的362头个体氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类和双酰胺类杀虫剂靶标基因的突变情况。【结果】 草地贪夜蛾部分个体在氨基甲酸酯类药剂靶标乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase）基因ace-1上存在突变,种群有6种ace-1基因型。ace-1基因检测到A201S和F290V位点突变;其中A201S均为抗性杂合突变,突变频率为8.4%;F290V为14.9%的抗性纯合突变和25.7%的杂合突变,未检测到G227A位点突变。重点防范区F290V位点突变频率高于迁飞过渡区和周年繁殖区,而在A201S位点突变频率均低于两区。长城防线、黄淮海阻截攻坚带、长江流域以及西南华南监测防控带ace-1基因突变频率均较高。A201S和F290V突变频率在2021年均较2020年种群略有下降,但无显著性差异。拟除虫菊酯类药剂靶标电压门控钠通道（voltage-gated sodium channel）基因vgsc和双酰胺类药剂靶标鱼尼丁受体（ryanodine receptor）基因ryr均未检测到靶标基因突变。【结论】 草地贪夜蛾种群氨基甲酸酯类靶标基因已发生较高频率的突变,说明对氨基甲酸酯类杀虫剂已产生较高水平的抗药性,在草地贪夜蛾的防控中应尽量减少使用。本研究显示草地贪夜蛾拟除虫菊酯类和双酰胺类杀虫剂靶标基因尚未检测到突变,这两类杀虫剂可与其他作用机制药剂科学轮换用于草地贪夜蛾的防控,鉴于目前已检测到这两类药剂的靶标基因突变个体,以及其国内近缘种甜菜夜蛾对这两类药剂存在较为普遍的杀虫剂靶标基因突变等情况,今后应开展草地贪夜蛾在室内外药剂高选择压力下以及寄主变化对主要防控药剂的靶标基因突变的影响,并加快抗药性快速检测技术和产品研究。     

153份新疆冬小麦品种3个条锈病抗性基因的分子检测

【目的】 研究条锈病抗性基因Yr 9、Yr 26、Yr Tp1在新疆153份冬小麦品种中的分布,为新疆小麦抗病育种提供理论依据。【方法】 利用SSR分子标记,采用PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,检测供试材料中是否含有小麦条锈病抗性基因Yr 9、Yr 26和Yr Tp1。【结果】 在123份冬小麦地方品种和30份冬小麦育成品种中,Yr 9基因的检出率分别为78.86%和63.33%,Yr 26基因的检出率分别为95.12%和73.33%,Yr Tp1基因的检出率分别为88.62%和60%。在123份冬小麦地方品种中,有87份供试材料能同时检测出3个条锈病抗病基因,占比70.73%;28份供试材料能同时检测出2个条锈病抗性基因(Yr 9+Yr 26、Yr 9+Yr Tp1、Yr 26+Yr Tp1),占比22.76%;1份供试材料只能检测出Yr 9基因;5份供试材料只能检测出Yr 26基因。在30份冬小麦育成品种中,15份供试材料可以同时检测出3个条锈病抗性基因,占比50%;7份供试材料可以同时检测到2个抗性基因(Yr 9+Yr 26、Yr 26+Yr Tp1)的材料,占比23.33%。【结论】 携带Yr 9、Yr 26、Yr Tp1小麦条锈病抗性基因的新疆冬小麦种质资源丰富,可以作为抗病育种的中间材料。     

福清山羊与努比亚黑山羊发情期卵巢组织RNA-Seq分析

【目的】 研究福清山羊与努比亚黑山羊发情期卵巢组织转录组差异表达水平,一方面为山羊繁殖性状形成的分子机制提供理论依据,另一方面为利用努比亚黑山羊杂交改良福清山羊提供可加快遗传进展的分子标记。【方法】 利用转录组测序方法对福清山羊和努比亚黑山羊发情期卵巢组织进行研究,筛选品种间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,并对DEGs功能进行注释和若干基因荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）验证;同时通过与参考基因组比对,分析和筛选测序样品中存在的SNP/InDel。【结果】 6个样品共得到46.68Gb Clean Data,DESeq分析发现了福清山羊和努比亚黑山羊发情期卵巢组织的DEGs149个（包含25个新转录本）,其中表达上调53个,表达下调96个;初步认为输卵管素基因（oviductin,OVN）、类固醇合成快速调节蛋白基因(steroidogenic acute regulatory protein,STAR)、早期生长应答1基因(early growth response 1,EGR1)可作为福清山羊繁殖性能的候选基因。149个DEGs中的108个基因能被GO（gene ontology）数据库注释,30个DEGs能够被COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）数据库注释,91个DEGs能够被KEGG（kyoto encyclopediaof genes and genomes）数据库注释。KEGG通路分析表明DEGs共富集到21条信号通路中,6条通路显著富集。经过进一步的与参考基因组序列比对分析,共发掘1 506个新转录本。经qRT-PCR验证,所选基因（转录本）表达变化模式与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。【结论】 在转录组水平上筛选出了福清山羊和努比亚黑山羊发情期卵巢组织的149个DEGs,发掘了1 506个新转录本,初步揭示了OVN、STAR和EGR1在山羊繁殖过程中可能发挥重要作用,为进一步探索山羊繁殖性状相关机理提供参考依据。