蛋白激酶A催化亚基VdPKAC1对菌丝型大丽轮枝菌V07DF2培养性状及致病力的调控

【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。     

成团泛菌对玉米自交系PS056致病性基因yhfK的克隆

 【目的】通过克隆和鉴定成团泛菌(Pantoea agglomerans)的致病相关基因,阐明该种土壤习居细菌在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的原因。【方法】利用转座子Tn5的随机插入突变特点,构建致病性菌株P. agglomerans XJ1突变体库;经对Tn5插入位点的侧翼扩增,确认突变体PA121的致病力相关基因;通过基因互补试验,证明yhfK与致病力的关系。【结果】通过对突变菌株的接种筛选,获得11个致病力丧失的突变体。Southern杂交和PCR扩增结果表明,Tn5在突变体PA121中为单拷贝插入,插入位点为细菌编码内膜蛋白的yhfK(Tn5 插入在yhfK的1 082 bp处)。将yhfK克隆到质粒pBBR1MCS上,并导入突变体PA121中进行互补,生物测定结果显示转化子完全恢复了正常的细菌生理功能,并能够在玉米自交系PS056上恢复致病力。RT-PCR试验证明,yhfK调控hrpA的转录。【结论】 成团泛菌XJ1中yhfK是调控其对植物致病性的基因之一,具有在玉米自交系PS056上引起细菌性干茎腐病的功能。     

CgRGS7调控胶孢炭疽菌分生孢子产量、附着胞形成及致病性

【目的】G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白信号转导通路中的负调控因子,参与多个G蛋白信号通路介导的细胞内过程,目前对于胶孢炭疽菌相关RGS蛋白的生物学功能研究较少。【方法】本研究通过同源重组获得CgRGS7基因的敲除突变体,并对其生物学功能进行初步分析。【结果】CgRGS7基因编码620个氨基酸,具有7个跨膜结构域和1个RGS功能域。CgRGS7敲除突变体与野生型菌株相比,表现为分生孢子产量降低且孢子呈多端萌发,附着胞形成率下降以及致病性减弱。【结论】CgRGS7参与调控胶孢炭疽菌分生孢子产量,同时影响芽管的形态发育、附着胞形成及致病性。     

稻瘟菌糖原合成酶激酶MoGSK3功能探究

【目的】观测稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）糖原合成酶激酶基因MoGSK3敲除突变体表型,明确MoGSK3在稻瘟菌中的潜在生物学功能,为挖掘防治稻瘟菌新型药剂的潜在靶标提供参考。【方法】基于同源重组原理,用split-PCR方法获得稻瘟菌MoGSK3敲除突变体菌株,将MoGSK3基因克隆到pFL2载体上得到MoGSK3-C融合载体,并将其通过PEG介导的原生质体转化法导入MoGSK3突变体中得到回补菌株。培养观察野生型菌株Guy11、突变体菌株G3-9及回补菌株GC-1的菌落形态和生长状况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测稻瘟菌产孢相关基因的表达量;观察稻瘟菌不同菌株的分生孢子形态,通过附着胞洋葱表皮穿透试验及接种水稻叶片,研究其致病力;通过KI-I-2染色对野生型菌株Guy11及突变体菌株G3-9分生孢子和附着胞中的糖原运输能力进行观测。【结果】稻瘟菌MoGSK3突变体存在多个表型缺陷,与野生型菌株Guy11相比,MoGSK3突变体菌株G3-9菌落直径显著变小,生长缓慢,产孢相关基因表达量下降且分生孢子出现末端伸长畸形的状态。MoGSK3基因缺失还会导致稻瘟菌菌丝末端无法形成正常的分生孢子梗,附着胞无法穿透洋葱表皮形成侵染菌丝,接种划伤水稻叶片也无法形成褐色病斑。对MoGSK3突变体菌株G3-9分生孢子及附着胞进行糖原染色后发现,突变体菌株G3-9在糖原转运能力方面存在明显缺陷。【结论】MoGSK3基因参与稻瘟菌的生长、分生孢子形成及形态建成、侵染、糖原转运等过程,是稻瘟菌重要的毒力因子。     

内生芽孢杆菌BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因与定殖相关性

【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因（β-1,4-endoglucanase gene,eglS）,探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异（P＜0.05）。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株（P＜0.05）。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P＜0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析

【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺失的突变体1个,果胶酶分泌降低的突变体6个;④菌核型突变体的致病力普遍高于野生型。获得了6个致病力减弱的突变体;⑤突变体侧翼序列与同种的大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组的序列一致性在95%—100%之间,与不同种的黑白轮枝菌VaMs.102序列的一致性为87%—94%。【结论】农杆菌介导的T-DNA随机插入可用于棉花黄萎病菌突变体的构建,突变体微菌核的产生与其产孢能力、致病性存在相关关系。美国大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组可用作黄萎病菌VD991功能基因研究的参考序列。     

慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列（KY235336）特点,分别在其5'和3'端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5'和3'端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白（mCherry）的DNA片段（CAG-mCherry）替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA（sgRNA1~sgRNA4）均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段（CAG-mCherry）插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。     

解淀粉芽胞杆菌SQR9亲缘识别与辨别相关基因的筛选

[目的]依据不同基因突变体的群集运动表型研究解淀粉芽胞杆菌SQR9中参与亲缘识别和辨别过程的关键基因。[方法]利用带有mariner转座元件的穿梭质粒pMarA,构建菌株SQR9的突变体文库,同时结合实验室已保存突变体,通过Swarming平板对峙表型进行筛选,找到与菌株SQR9和FZB42表型发生变化的突变株。针对Swarming表型变化转座子突变株,利用反筛标记pheS进行基因无痕敲除验证与表型验证。[结果]敲除菌株SQR9的sinR、fliD、flhO和degU基因后影响其亲缘识别野生型亲本菌株的能力。定点敲除菌株SQR9的flhO基因后发现,Swarming表型与Tn转座插入突变体一致,都与野生型菌株SQR9形成边界表型,可能参与亲缘识别过程。敲除spo0A调控基因显著影响菌株SQR9的功能,其与解淀粉芽胞杆菌FZB42的对峙边界表型消失,可能参与非亲缘排斥。[结论]解淀粉芽胞杆菌SQR9中全局性调控基因(spo0A、sinR和degU)、鞭毛蛋白合成相关基因(fliD和flhO)、芽孢萌发基因(gerAA和gerAB)、抗生素合成基因(srfAA)及其他基因(patB和yugK)可能参与菌株SQR9的亲缘识别与辨别系统。     

菊欧氏杆菌细菌素基因的鉴别及探针的建构

放射自显影结果表明,质粒pZJ25::Tn5与Tn5诱变的不产细菌素的菊欧氏杆菌质拉DNA有同源杂交带,并且这些突变体的质粒分别能通过转化或接合转移到不产细菌素的去质粒菌株和大肠杆菌,得到抗卡那霉素的转化子和接合子。这证明转座子Tn5插入在质粒pWZ12产细菌素有关的基因上。 通过DNA重组的方法建构了一个分子量约为10.2Kb的细菌素探针质粒,pBR1210。它与质粒pWZ12有专一性的同源杂交带。     

Web2.0,以个人为中心的互联网时代的到来

本文介绍了Web2．0的知识和背景，对Web2．0出现的基础以及典型技术和应用作了阐述，同时对其作出了前景展望。     

盐胁迫对葡萄苗期多胺和激素代谢的影响

【目的】 研究盐胁迫条件下,葡萄叶片中多胺含量、多胺氧化酶、多胺合成酶活性以及激素的动态变化,研究不同盐胁迫强度对多胺类物质及激素代谢的影响。【方法】 采用盆栽基质培养模拟盐胁迫环境,设置4个NaCl处理梯度:0 (CK)、1、2和3 g/kg。多胺和激素含量的测定采用高效液相色谱法,多胺合成及分解酶活性的测定采用紫外分光光度计比色法。【结果】 盐胁迫处理后,葡萄叶片中多胺含量和脱落酸含量较对照而言显著增加,玉米素含量显著降低,随胁迫时间的延长,Put、Spm、Spd、ABA以及PAO、DAO、ADC、ODC、SAMDC活性均呈先上升后下降趋势,在10 d及10 d后达到峰值。ZT呈逐渐下降的趋势,并随胁迫强度增大而减小;进行显著性分析后,叶片中多胺含量与Put、Spm、Spd含量呈极显著正相关,DAO、ADC、ODC活性与Put含量呈显著正相关,PAO与SAMDC活性与Spm和Spd含量也呈极显著正相关。【结论】 3种多胺经酶的合成代谢后和激素共同缓解葡萄苗所遭受到的盐胁迫,期间主要发生作用的是多胺合成酶,盐胁迫下多胺与激素含量之间的变化关系也十分密切。     

市级综合气象信息分析与管理系统的设计与实现

以抚顺地区3个国家基本站50余年气象资料为依托,采用Microsoft Excel工作表实现由气候和农业气候2部分构成的气象与农业综合信息处理系统的基本思路、方法、内容、用途和使用情况。为了实现气候分析及应用的科学化、客观化、系统化、规范化、程序化及连续化的业务目标,按业务流程设计与实现的,包括资料处理、气候趋势模拟、气候预测、气候鉴定、季节性信息化处理、农作物产量预报、气候生产潜力分析等一系列内容在内的系统建设。关键是解决了大量的计算问题,建立了区域性通用模式。     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

Multi-variable grey model (MGM (1,n,q)) based on genetic algorithm and its application in urban water consumption

Urban water consumption has some characteristics of grey because it is influenced by economy, population, standard of living and so on. The multi-variable grey model （MGM（1,n））, as the expansion and complement of GM（1,1） model, reveals the relationship between restriction and stimulation among variables, and the genetic algorithm has the whole optimal and parallel characteristics. In this paper, the parameter q of MGM（1,n） model was optimized, and a multi-variable grey model （MGM（1 ,n,q）） was built by using the genetic algorithm. The model was validated by examining the urban water consumption from 1990 to 2003 in Dalian City. The result indicated that the multi-variable grey model （MGM（1,n,q）） based on genetic algorithm was better than MGM（1,n） model, and the MGM（1,n） model was better than MGM（1,1） model.     

Molecular detection of virulence genes in Campylobacter species isolated from livestock production systems in South Africa

Campylobacter species are a major cause of foodborne bacterial infections in both developed and developing countries worldwide. Campylobacter jejuni is responsible for the majority of infections. This study was conducted to identify virulenceassociated genes in Campylobacter species isolated from livestock production systems in South Africa. A total of 250 fecal samples consisting of cattle(n=50), chickens(n=50), goats(n=50), sheep(n=50) and pigs(n=50) were randomly collected from livestock in Eastern Cape and KwaZulu-Natal provinces of South Africa between April and October 2018. The samples were analyzed for the presence of virulence genes in Campylobacter species using molecular PCR-based methods. It was found that 77 and 23% of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli respectively were isolated from all the livestock samples. There were positive significant(P0.05) correlations amongst all the virulence genes that were investigated. Chisquare and Fisher's exact tests were implemented to test for the effect of livestock species on the presence or absence of virulence genes. The study demonstrated that most of livestock species can potentially cause zoonotic infections and food poisoning due to the high prevalence of Campylobacter. The high prevalence of virulence genes highlights the significance of Campylobacter in livestock production systems in South Africa. This requires the implementation of one-health approaches to reduce the impact of foodborne and zoonotic diseases for the welfare of human and animal health.     

红苕饲粮中添加铜和/或喹乙醇对猪生产性能及某些血液生化指标的影响

选体重约38公斤的长白(♂)×成华(♀)杂交猪20头,随机分为四组,饲予四种不同的饲粮,研究饲粮中添加铜和/或喹乙醇对猪生产性能和某些血液生化指标的影响。结果表明:基础组、加铜组、加喹乙醇组和两者同时加组全期日增重分别为674、761、796、678克,日采食量分别为2.50、2.65、2.74、2.40公斤,饲料利用率分别为3.73、3.49,3.44、3.54,添加铜和/或喹乙醇对试验第65天血清铜兰蛋白、尿素氨及屠宰率、背膘厚和眼肌面积无显著影响(p>0.05);添加铜使65天血清碱性碱酸酶活性极显著增高(p<0.01),添加喹乙醇有使之升高的趋势,两者同时添加时,碱性酸磷酶活性降低。