牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。     

牙鲆胚后发育阶段HDAC1基因的空间表达

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)可通过调节染色质结构和抑制特异性转录因子活性来调控细胞生长和分化。鉴于HDACs在蝌蚪变态发育过程中的作用,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)HDAC1基因全长cDNA序列,并调查了其在牙鲆变态前和变态阶段的空间表达。牙鲆HDAC1全长cDNA序列为2 540 bp,包含长度为126 bp的5'UTR,1 470 bp的ORF和944 bp的3'UTR。HDAC1基因在牙鲆变态前以及变态阶段均有表达,这和蝌蚪中仅在变态前表达的现象不同。HDAC1在冠状幼鳍上的表达是随着幼鳍原基的生长发育逐渐增强的,直至冠状幼鳍分化成形后,基因表达减弱;随着牙鲆仔鱼肠道的变粗变短,HDAC1在肠壁的表达强度逐渐增强,孵化后第16天(16DAH)开始减弱并最终消失;鳍褶中HDAC1在9DAH开始表达,18DAH时主要在鳍褶基部表达,进入变态阶段,HDAC1可见在支鳍骨上表达,在变态高峰期表达最为强烈。在整个变态发育期HDAC1在鳃上均表达,变态开始后表达逐渐增强,而到变态后期表达减弱。牙鲆变态前及变态阶段的HDAC1基因表达模式表明,HDAC1参与了牙鲆冠状幼鳍、鳍条、肠道等多种器官的发育调控以及变态阶段眼睛移动的过程。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。本研究采用末端快速扩增法获得了牙鲆ras-2基因全长2384bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P-loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初较高,随着变态进行,表达水平显著降低。RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在牙鲆变态阶段的鳍条、眼眶周围、颔、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍条和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在鳍条和鳃,变态高峰期(F期和G期)信号主要集中在鳍条、鳃和颔,H期表达信号主要集中在鳃和鳍条。ras-2基因表达式型显示,其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和变态时期的表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Paralichthys olivaceus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表达水平显著降低。牙鲆变态阶段的RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在鳍条、眼眶周围、颌、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍褶和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在支鳍骨和鳃,变态高峰期（F期和G期）信号主要集中在支鳍骨、鳃和颌,H期表达信号主要集中在鳃和支鳍骨。ras-2基因表达式型表明其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

Tbx5基因在漠斑牙鲆（Paralichthys olivaceus）变态前的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。我们运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2d（变态早期）和26d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2d胸鳍原基出现,出膜后26d胸鳍发育成熟,而在出膜后26d胸鳍和腹鳍仍呈现左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果暗示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。 研究亮点： 鲽形目鱼类都经历变态发育过程,产生显著的左右不对称形态,但调控该过程的分子机制尚不清楚。本文对牙鲆变态初期仔鱼进行了形态学观察,并对牙鲆Tbx5进行克隆及其表达分析,并探讨Tbx5与牙鲆仔鱼眼睛与胸鳍不对称变态过程的关系,为进一步研究牙鲆变态机制奠定基础。     

褐牙鲆早期发育阶段CRH基因表达及 受甲状腺激素的影响

[目的]探析褐牙鲆仔鱼早期发育阶段促肾上腺皮质激素释放激素基因(CRH)的表达情况及受甲状腺激素的影响作用,为开展牙鲆的人工繁育提供科学依据.[方法]通过实时荧光定量PCR检测褐牙鲆早期发育阶段CRH基因表达量,以ELISA测定褐牙鲆仔鱼甲状腺激素(T3和T4)水平,并测定经外源T3浸泡处理后早期发育褐牙鲆仔鱼CRH基因表达量的变化情况,探究CRH和甲状腺激素在褐牙鲆早期发育阶段的影响及作用关系.[结果]1~8日龄褐牙鲆仔鱼CRH基因相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在5日龄达最高值,显著高于其他日龄的仔鱼(P<0.05,下同).10~42日龄褐牙鲆仔鱼CRH基因主要在其头部表达,尾部CRH基因的相对表达量随着生长发育的进程而逐渐增加.褐牙鲆仔鱼变态前期甲状腺激素T4含量逐渐增加,变态高峰期迅速升高,在变态后期呈下降趋势.较其他早期发育时期,甲状腺激素T3在褐牙鲆变态期维持高水平,但含量低于甲状腺激素T4.22日龄褐牙鲆仔鱼经50 nmol/L外源T3处理2 h后,其头部和尾部CRH基因的相对表达量显著升高;但以外源T3处理8 h后,无论是头部还是尾部,CRH基因的相对表达量均呈显著下降趋势.[结论]褐牙鲆早期变态发育需CRH基因高表达及甲状腺激素积累,二者对褐牙鲆早期变态发育阶段具有重要作用并呈互相代偿效应.     

Tbx5基因在牙鲆变态初期的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2 d（变态早期）和26 d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2 d胸鳍原基出现,出膜后26 d胸鳍发育成熟,而在出膜后26 d胸鳍和腹鳍仍左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26 d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果显示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。     

Let-7d在牙鲆变态发育期间的表达及靶基因预测

MicroRNAs(miRNAs)通过抑制编码基因的转录调控关键的生物学进程。研究发现,let-7是时序发育过程中的重要调控因子,在促进幼体向成体转变的发育过程中起着极其重要的作用。利用Solexa测序技术从牙鲆中成功鉴定出let-7家族的10个成员((let-7a,let-7b,let-7c,let-7d,let-7e,let-7f,let-7g,let-7h,let-7i,let-7j)。相对于let-7家族其他成员,let-7d的拷贝数最多,推测其在牙鲆发育过程中扮演着更重要的角色。运用实时荧光定量PCR方法分析let-7d在牙鲆变态发育不同时期的表达,结果发现,在对照组和甲状腺激素处理组,let-7d的表达模式类似:前5个时期(孵化后17 d,17dph;变态Ⅰ期,20 dph;变态Ⅱ期,23 dph;变态Ⅲ期,29 dph;变态Ⅳ期,36dph)表达量逐渐上升;变态晚期(36 dph)达到高峰;变态结束(41 dph)表达量呈现下降的趋势。定量结果显示,甲状腺激素下调let-7d的表达,与对照组呈显著性差异(P<0.05)。对牙鲆不同组织中let-7d的表达情况分析表明,let-7d主要存在于牙鲆的头部(脑,鳃,心脏)。靶基因预测发现,在目前已公布的482条牙鲆mRNA序列中,其中有30条mRNA的3’非翻译区(3’-UTRs)存在let-7d结合位点。这些预测的靶基因涉及到发育过程的许多方面:蛋白折叠,细胞分化,信号转导,病毒免疫反应和信号通路等。这些结果说明,let-7d在调控牙鲆从仔鱼向稚鱼转变的变态发育过程中起着极其重要的作用。     

牙鲆Follistatin cDNA的克隆与序列分析

为研究海水鱼中Follistatin基因的序列特征,从受精后67 h的牙鲆受精卵中克隆获得牙鲆Follistatin基因cDNA序列,并对其进行序列分析.结果表明,在牙鲆中并没有发现Follistatin基因的可变式剪切现象;牙鲆Follistatin基因cDNA序列全长963 bp.序列分析结果显示:牙鲆与Takifugu rubripes的亲缘关系最近.Follistatin蛋白中高度保守的半胱氨酸和甘氨酸残基的生物学功能可能是维持蛋白空间结构的稳定.     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2 947 bp,开放阅读框(ORF)2 418 bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1 receptor)。该蛋白的分子量为91.15 kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%～35%,TIR序列的同源性达到84%～62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

牙鲆Follistatin基因启动子克隆与分析

为研究海水鱼中Follsitatin基因的组织表达特异性,利用PCR方法获得牙鲆Follistatin基因启动子并进行序列分析,用RT-PCR和显微注射方法研究Follistatin基因与肌肉发育的关系.结果表明,所获得的启动子含有USF、F47、MyoD、NF-Y等多种转录因子结合位点;在牙鲆成体组织中,Follistatin基因在体肾、肠、心脏、头肾、脾中有表达,而在肌肉和肝脏中没有表达;显微注射证明Follistatin基因参与了肌肉的早期发育.     

抗浪鱼MC4R基因的PCR扩增及序列分析

[目的]对抗浪鱼MC4R基因进行PCR扩增。[方法]采用PCR方法,依据鲫鱼的黑素促黑素受体-4（MC4R）基因保守区的核苷酸序列,采用引物设计软件,对抗浪鱼的MC4R基因设计出一对引物进行PCR扩增和纯化测序,并利用phylip软件对抗浪鱼和其他已知MC4R基因序列的鱼类构建基因进化树。[结果]抗浪鱼MC4R基因的扩增长度为1001bp。9种鱼类的MC4R核苷酸序列聚为2大类。其中,比目鱼单独聚为一类;斑剑尾鱼、舌齿鲈、白斑角鲨、斑马鱼、抗浪鱼、黑青斑河豚、中华多纪豚和红旗东方豚聚为一类。[结论]抗浪鱼与斑马鱼的亲缘关系最近,与比目鱼的亲缘关系最远。     

牙鲆lin-29基因的全长cDNA克隆、鉴定及其在早期发育中的表达分析

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中获得牙鲆lin-29基因c DNA序列,该序列全长1 769 bp,包括1 329 bp开放阅读框,编码442个氨基酸,预测其是一种多锌指结构蛋白;氨基酸序列对比分析显示,牙鲆LIN-29与大黄鱼(Larimichthys crocea)的同源性最高,达95.25%;系统进化树分析表明,牙鲆与其他鱼类聚集一支,并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量PCR显示,在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段,以原肠胚期lin-29表达量最高;组织表达分析表明,脑中表达最高,肌肉中最低。外源甲状腺激素(TH)在牙鲆仔鱼发育初期(TH处理后2 d、5 d)下调lin-29表达,TH处理后21 d(36 dph)和26 d(41 dph)上调lin-29基因表达,同时,硫脲(TU)处理均显著上调lin-29表达。结果显示牙鲆lin-29基因可能在牙鲆早期发育过程中扮演着重要的角色,为进一步研究lin-29在牙鲆生长发育中的功能奠定基础。     

牙鲆鱼肠道鼠李糖乳杆菌P15的分子鉴定与系统发育分析

[目的]对1株分离自健康牙鲆鱼肠道固有菌群的乳杆菌P15进行分子鉴定。[方法]利用PCR技术测定该菌株的16S rRNA基因序列,然后在GenBank中进行相关细菌相应序列的同源性比对,利用MEGA（4.0）软件进行系统发育学分析。[结果]获得了该菌株的16S rRNA基因序列（登录号为AY852248）。菌株P15与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的亲缘关系最近。[结论]菌株P15被鉴定为鼠李糖乳杆菌。     

用蒙古裸腹溞替代卤虫喂养大菱鲆和牙鲆鱼苗的试验研究

研究了蒙古裸腹溞MoinamongolicaDaddy在室内水泥池中的大规模培养技术,并进行了用其部分或全部替代卤虫投喂大菱鲆Scophtalmusmaximus和牙鲆Paralichthysolivaceus稚幼鱼的试验,结果表明:蒙古裸腹溞在室内大规模培养是可行的;全用小球藻培养的蒙古裸腹溞以及经小球藻营养强化的用酵母培养的蒙古裸腹溞作饵料,完全可以满足大菱鲆及牙鲆鱼苗的营养需要。用不同食物组合投喂大菱鲆的试验表明,鱼类生长速度为50%裸腹溞+50%卤虫组>裸腹溞组>卤虫+配合饲料组,但差异不显著;用该溞投喂牙鲆组的鱼类生长与用卤虫投喂组的没有显著差异。而蒙古裸腹溞培养费用仅为卤虫的1/10,因此,用蒙古裸腹溞可以部分替代或全部替代卤虫作为大菱鲆及牙鲆鱼苗的优质饵料,大幅度降低育苗成本。